中华预防医学杂志    2014年06期 山东省O139群霍乱弧菌的分子特征及耐药性研究    PDF     文章点击量:4504    
中华预防医学杂志2014年06期
中华医学会主办。
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袁玉起 吕慧 周海健 崔志刚 孙娜 关冰 邵坤 毕振旺 阚飙 毕振强
YuanYuqi,LyuHui,ZhouHaijian,CuiZhigang,SunNa,GuanBing,ShaoKun,BiZhenwang,KanBiao,BiZhenqiang
山东省O139群霍乱弧菌的分子特征及耐药性研究
Molecular characteristics and antibiotic resistance of Vibrio cholerae O139 in Shandong province
中华预防医学杂志, 2014,48(6)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.007
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投稿日期: 2013-10-21
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山东省O139群霍乱弧菌的分子特征及耐药性研究
袁玉起 吕慧 周海健 崔志刚 孙娜 关冰 邵坤 毕振旺 阚飙 毕振强     
袁玉起 250012 济南,山东大学公共卫生学院流行病与卫生统计学研究所
吕慧 山东省疾病预防控制中心山东大学预防医学研究院
周海健 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室
崔志刚 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室
孙娜 山东省疾病预防控制中心山东大学预防医学研究院
关冰 山东省疾病预防控制中心山东大学预防医学研究院
邵坤 山东省疾病预防控制中心山东大学预防医学研究院
毕振旺 山东省疾病预防控制中心山东大学预防医学研究院
阚飙 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室
毕振强 250012 济南,山东大学公共卫生学院流行病与卫生统计学研究所
摘要: 目的  调查山东省O139群霍乱弧菌分子流行病学特征及耐药谱。方法  对山东省自1997年O139群霍乱疫情出现以来分离的13株O139群霍乱弧菌(9株为临床分离株,4株为环境株)进行生化鉴定及血清型复核,同时进行PFGE分子分型和毒力基因及耐药相关基因检测,使用微量肉汤稀释法检测其耐药性。结果  山东省13株O139群霍乱弧菌聚类为7个PFGE型别,其中2013年济宁的1株临床株和2株环境株聚为KZGN11O139.CN0077,2005年济南的1株临床株、2005年济宁的1株临床株和2009年菏泽的1临床株聚为KZGN11O139.CN0002,其余均各自为不同的型别。2株烟台临床株缺失ctxABtcpI基因,PFGE条带也较为特殊,其他11株霍乱弧菌均含有hlyActxABtoxRtcpIrtxAtcpA 6种毒力基因。13株霍乱弧菌均含有耐药相关基因intI 1、intI 4及sxt。在12种抗生素中,卡那霉素、复方磺胺甲恶唑、氨苄西林及庆大霉素的耐药率分别为11/13、9/13、7/13和7/13。结论  山东省O139群霍乱弧菌PEGE分型提示菌株间可能存在流行病学关联,多数菌株产毒且耐药。
关键词 :弧菌,霍乱;电泳,凝胶,脉冲场;毒力;耐药
Molecular characteristics and antibiotic resistance of Vibrio cholerae O139 in Shandong province
YuanYuqi,LyuHui,ZhouHaijian,CuiZhigang,SunNa,GuanBing,ShaoKun,BiZhenwang,KanBiao,BiZhenqiang     
Department of Epidemiology and Health Statistics, School of Public Health, Shandong University, Jinan 250012, China
Corresponding author: Bi Zhenqiang, Email: bzq63@163.com
Abstract:Objective  To investigate the molecular epidemiological characteristics and antibiotic resistance profiles of Vibrio cholerae O139 in Shandong province.Methods  A total of 13 strains of V. cholerae O139 (9 clinical strains and 4 environmental strains) isolated from cholera epidemics in Shandong province since 1997 were recovered and confirmed with serum agglutination and biochemical reaction. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was carried out for molecular subtyping. Virulence genes and drug resistance related genes were detected by PCR. Antibiotic susceptibility tests were performed using micro-broth dilution method.Results  Thirteen strains of V. cholerae O139 were differentiated into seven pulsetypes. One clinical strain and two environmental strains isolated from Jining in 2013 were clustered into the pulsetype namely KZGN11O139. CN0077, and an identical PFGE pattern of KZGN11O139. CN0002 was found among three clinical strains from Jinan in 2005, Jining in 2005 and Heze in 2009. Other pulsotypes were unique in China and found only in Shandong province. Because of deletion of ctxAB and tcpI, the PFGE patterns of two strains isolated from Yantai in 2000 and 2004 were different from other 11 strains which harbored ctxAB, tcpA, tcpI, rtxA, hlyA and toxR. All strains contained one or more drug resistance related genes such as intI 1, intI 4 and sxt, and were resistant to two kinds of antibiotics at least. Among the 12 kinds of antibiotics, the resistant ratioes to kamamycin, trimethoprim-sulfamethoxazole, ampicillin and gentamicin were 11/13, 9/13, 7/13 and 7/13, respectively.Conclusion  Molecular subtyping indicates possible epidemiological links among V.cholerae O139 in Shandong province, and almost all strains were toxigenic and drug resistant.
Key words :Vibrio cholerae;Electrophoresis,gel,pulsed-field;Virulence;Antibiotic resistance
全文

霍乱弧菌是烈性肠道传染病霍乱的病原菌,可分为200多个血清群,其中O1群和O139群是引起人类疾病的主要血清群。1997年在烟台市莱阳县发现了山东省首例O139群霍乱病例,之后山东省内发生多起O139群霍乱散发疫情。作为甲类烈性传染病,霍乱一直威胁着人们的健康,仍然不能排除大规模疫情出现的可能。笔者对山东省分离的O139群霍乱弧菌进行了PFGE分子分型,以及毒力、耐药相关基因检测和耐药谱分析,为O139群霍乱防控提供实验室数据支持。

材料与方法  

一、材料  

1.菌株:  山东省自1997年O139群霍乱疫情出现以来分离的所有O139群霍乱弧菌共13株,其中9株为临床分离株,4株为环境株(图1),PFGE分型标准菌株为沙门菌H9812,药敏实验质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

图11997–2013年山东省13株O139群霍乱弧菌PFGE聚类图

2.试剂:  碱性蛋白胨水和碱性琼脂培养基(北京陆桥技术有限公司),脑心浸液培养基(英国Oxoid公司),O139群霍乱弧菌诊断血清(宁波天润生物药业有限公司),革兰阴性菌生化鉴定卡(法国BioMérieux公司),核酸提取试剂盒(DNeasy Blood & Tissue kit,美国Axygen公司),PCR Master Mix和电泳用琼脂糖(美国Promega公司),毒力基因和耐药基因引物(深圳华大基因研究院),50×核酸电泳(TAE)缓冲液[生工生物工程(上海)股份有限公司],药敏最低抑菌浓度(MIC)试剂盒(天津金章科技发展有限公司),Tris–HCl缓冲液、EDTA和5×Tris–硼酸(TBE)(北京索莱宝科技有限公司),限制性内切酶NotⅠ和XbaⅠ[宝生物工程(大连)有限公司],蛋白酶K(德国Merck公司),SeaKem Gold琼脂糖(瑞士Lonza公司),GelRed(美国Biotium公司)。

3.仪器:  恒温培养箱(德国Binder公司),恒温水浴箱(美国PolyScience公司),VITEK 2 COMPACT生化鉴定系统(法国BioMérieux公司),QIAtube核酸提取仪(德国Qiagen公司),2720 Thermal Cycler PCR仪(美国Applied Biosystems公司),电泳仪(北京六一仪器厂),CHEF Mapper脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio–Rad公司),FluorChem FC2凝胶成像仪(美国Alpha Innotech公司)。

二、方法  

1.菌株复苏及复核鉴定:  冻干保存的O139群霍乱弧菌经蛋白胨水增菌培养后,接种于脑心浸液培养基进行分离培养。单菌落按照《霍乱防治手册》(第6版)[1]方法进行O139群血清凝集和生化鉴定。

2.PFGE分型:  按照霍乱弧菌PFGE分型的标准方案进行操作[2],按照中国细菌性传染病分子分型实验室监测网络(PulseNet China)的图谱要求,细菌裂解时间为1 h, Not Ⅰ酶切时间为4 h。电泳条件:第1阶段初始和最终转换时间分别为2和10 s,电泳时间为13.5 h,第2阶段初始和最终转换时间分别为20和25 s,电泳时间为6.2 h。分子量标准菌H9812用XbaⅠ酶切,电泳方法同上。

3.毒力和耐药相关基因检测:  采用核酸提取试剂盒制备PCR模板,配制25 μl PCR体系,引物见表1。PCR扩增条件为95 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环,72 ℃最终延伸5 min[3,4,5,6,7,8,9,10]。每次实验设置阴性和阳性对照。

表1霍乱弧菌的毒力基因和耐药基因引物序列

4.药敏实验:  根据《霍乱防治手册》(第6版)[1]和美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的抗菌药物敏感性试验执行标准(M100–S20)[11]进行微量肉汤稀释法耐药检测,包括氨苄西林、头孢曲松、阿奇霉素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、诺氟沙星、复方磺胺甲恶唑、多西环素、呋喃妥因和氯霉素12种抗生素,质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

5.聚类分析:  PFGE图谱录入Bionumerics 6.0软件,参照H9812条带校准,条带相似度采用基于条带的Dice系数计算[12],聚类分析采用非加权配对算术平均法(unweighted–pair group method using arithmetic averages,UPGMA)构建聚类树,条带优化值和位置差异容许度均为1.5%,肉眼校对带型完全相同者为同一PFGE型别,并与全国自1993年首次发现O139群霍乱以来的所有菌株PFGE图谱比对分析,进而按照PulseNet China数据规则进行型别命名,同时与山东省自1976年以来250株O1群霍乱弧菌PFGE条带进行聚类分析。

结果  

一、山东省O139群霍乱弧菌的PFGE分型  将13株O139群霍乱弧菌进行PFGE分型,均获得清晰的图谱,条带数目在20~24条之间,带型间相似度在81.8%~100.0%之间,分为7种PFGE带型,见图1。2013年济宁霍乱疫情从患者分离的1株菌(SD2013001)和从患者曾就餐酒店的2株环境株(SD2013002和SD2013003)聚为KZGN11O139.CN0077型,2005年济南1株临床株(SD2005001)、济宁1株临床株(SD2005004)和2009年菏泽1株临床株(SD2009001)聚为KZGN11O139.CN0002型,2004年淄博2株环境株(SD2004002和SD2004003)与2005年济宁1株临床株(SD2005003)聚为KZGN11O139.CN0338,其余均各自为不同的型别。烟台2000年和2004年临床株SD2000005和SD2004001缺失ctxABtcpⅠ基因,为非产毒株,PFGE图谱与ctxAB阳性菌株差异大。

二、山东省O139群霍乱弧菌与全国霍乱弧菌PFGE数据库比对结果  通过查询全国霍乱弧菌PFGE数据库发现,除了山东3株菌型别为KZGN11O139.CN0002外,还有重庆、福建、广东、湖南、江苏、江西、四川和浙江8个省份在2002–2009年期间分离到的87株O139群菌株也为同一型别。2013年山东分离3株菌型为KZGN11O139.CN0077,而这一型别也出现包括安徽、北京、广东、湖北、湖南、江苏、江西、四川、上海和浙江10个省份分离的52株O139群菌株,其中49株(89.1%)集中在2012–2013年,提示该克隆群的菌株近年来在我国多地传播。本次研究获得的其余5个带型与全国数据库中的341个O139群菌带型均存在差别,为我国新发现的型别。

三、山东省O139与O1群霍乱弧菌聚类分析结果  

1.聚类簇分析结果:  13株O139群霍乱弧菌与山东省250株O1群代表菌株可分为PⅠ、PⅡ和PⅢ3大簇,与血清分型基本吻合,其中11株O139群ctxAB阳性菌株聚成一簇,为PⅡ簇,另外2株ctxAB缺失的O139群菌株(SD2000001和SD2004001)带型较为特殊,与O1群ctxAB缺失菌株杂乱带型相似,均没有形成明显的聚类簇。

2.毒力和耐药相关基因:  在13株O139群霍乱弧菌中,除了2株从烟台患者分离的菌株SD2000005和SD2004001外,均含有6种毒力基因(表2)。耐药相关基因的检测结果表明,第一类整合子整合酶基因intI 1只在SD2000005、SD2005004和2013年分离株中检出,其余菌株均未检出;超级整合子整合酶基因intI 4除在SD2000005中未检出外,其余菌株均为阳性,携带率为12/13;整合性结合元件(sxt)在SD1997007、SD2000005、SD2009001及2013年分离株中检出,其他菌株均为阴性。

表2山东省13株O139群霍乱弧菌毒力和耐药相关基因分布情况

3.O139群菌株的药物敏感性检测:  在所测定的12种抗生素中,卡那霉素耐药最为严重,仅SD1997007和SD2004001菌株对卡那霉素敏感,耐药率达11/13;复方磺胺甲恶唑、氨苄西林和庆大霉素耐药率分别为9/13、7/13和7/13。诺氟沙星、环丙沙星、头孢曲松、氯霉素、阿奇霉素及阿米卡星6种抗生素对13株菌的耐药分布完全相同,SD200005和SD2005004两菌株对其均耐药,其余菌株均对此6种抗生素敏感,耐药率均为2/13。而呋喃妥因和多西环素未见耐药菌株,见表3

表3山东省13株O139群霍乱弧菌耐药谱

讨论  在第7次霍乱全球大流行中,O1群El Tor型霍乱弧菌于1964年传入山东[13],其后经历了稻叶和小川血清型的流行高峰。1997年在烟台莱阳检出了山东省首株O139群霍乱弧菌[14],此后霍乱疫情以散发为主。
        PFGE是基于细菌全基因组的分子分型方法,可提示不同菌株的可能流行病学关联[15,16]。在本研究中,PFGE分型与血清分型基本吻合,但PFGE分型可显示菌株间更多的差异和关联,不同菌株具有相同PFGE分型最有意义。2005年在济南和济宁分离的菌株PFGE图谱一致,这提示两地疫情可能有流行病学关联。2009年在菏泽再次出现具有该图谱的O139群菌株,可能是具有该基因组特征的菌株持续存在引起了新的病例。2013年从济宁患者及其就餐锅具上分离的菌株带型相同,提供了食物污染导致疫情出现的直接证据。
        通过与全国数据库比对发现,山东省O139群菌株中有两个PFGE型在多个省份均有出现,可认为是优势流行菌型,这也提示到目前为止至少有两起潜在的O139群霍乱全国流行波及山东。
        笔者选取了ctxABtcpAtcpIrtxAhlyAtoxR毒力基因[5,6,7],除了烟台两株缺失ctxABtcpI基因外,其他均为产毒株。与严寒秋等[17]研究结果类似,非产毒株仍可致病,表明霍乱弧菌可能存在霍乱毒素以外的致病机制。另外,两非产毒株PFGE条带与产毒株差异较大,带型更为多样化。
        随着抗生素的滥用,细菌耐药现象日益突出,整合子[18,19]和整合性结合元件[20,21]作为移动性基因元件可捕获整合外源性耐药基因,是霍乱弧菌产生耐药的重要原因之一。在本研究的菌株中,第一类整合子和整合性结合元件基因携带率均较高,超级整合子基因仅1株菌未检出,当然不能排除该基因在此菌株中发生了序列变异,与潘劲草等[22]和Yu等[23]的研究结果相似,提示O139群霍乱弧菌可产生严重的耐药性。除呋喃妥因外,O139群霍乱弧菌对其他11种抗生素均出现了不同程度的耐药,其中卡那霉素耐药率达11/13。
        综上所述,山东省O139群霍乱弧菌PFGE分型提示了可能存在的流行病学关联,为霍乱的溯源提供了有力支持。多数菌株为产毒株,且均携带耐药相关基因,对多数抗生素产生了不同程度的耐药性,需要规范临床用药及加强霍乱耐药性监测。

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