中华预防医学杂志    2014年06期 信号传导与转录激活因子3基因多态性与肝细胞癌的关系    PDF     文章点击量:3332    
中华预防医学杂志2014年06期
中华医学会主办。
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谢佳新 高秋菊 杨丹 刘天鹏 曹广文
XieJiaxin,GaoQiuju,YangDan,LiuTianpeng,CaoGuangwen
信号传导与转录激活因子3基因多态性与肝细胞癌的关系
Associations of signal transducer and activators of transcription 3 polymorphism with the susceptibility to hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma
中华预防医学杂志, 2014,48(6)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.018
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投稿日期: 2013-09-10
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信号传导与转录激活因子3基因多态性与肝细胞癌的关系
谢佳新 高秋菊 杨丹 刘天鹏 曹广文     
谢佳新 050081石家庄,白求恩医务士官学校军事预防医学教研室
高秋菊 050081石家庄,白求恩医务士官学校军事预防医学教研室
杨丹 050081石家庄,白求恩医务士官学校军事预防医学教研室
刘天鹏 050081石家庄,白求恩医务士官学校军事预防医学教研室
曹广文 第二军医大学流行病学教研室
摘要: 目的  探讨信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activators of transcription 3, STAT3)基因启动子区–1096G/C多态性与乙肝表面抗原(HBsAg)阳性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)易感性之间的关系。方法  采用病例–对照研究方法,应用荧光探针实时定量PCR法对2009至2012年在上海某医院就诊的632例HCC患者和723名非HCC乙肝病毒(HBV)感染者的STAT3基因启动子区–1096G/C基因多态性进行检测,使用单因素分析方法确定该基因多态性OR(95%CI)值。结果  对照组、病例组携带STAT3 –1096C(GC+CC)基因型者分别占61.8%(447/723)、60.6%(383/632),不同基因型之间HCC发病风险差异无统计学意义(OR=0.95,95%CI:0.76~1.18)。以性别进行分层分析,在男性人群中,对照组、病例组携带STAT3 –1096 C(GC+CC)基因型者分别占62.2%(314/505)、61.8%(331/536),在女性人群中,分别为61.0%(133/218)、54.17%(52/96),在男性和女性人群中,不同基因型HCC发病风险差异均没有统计学意义(OR=0.98,95%CI:0.77~1.26;OR=0.76,95%CI:0.47~1.26)。以HBV基因型进行分层分析,在HBV B型感染者中,对照组、病例组携带STAT3 –1096C(GC+CC)基因型者分别占61.5%(110/179)、53.1%(34/64),在HBV C型感染者中,对照组、病例组携带STAT3 –1096C(GC+CC)基因型者分别占62.9%(276/439)、60.3%(226/375),在HBV B或C型感染者中,不同基因型患者HCC发病风险差异没有统计学意义(OR=0.71,95%CI:0.40~1.26;OR=0.90,95%CI:0.68~1.19)。结论  STAT3 –1096G/C基因多态性与HBV阳性HCC的易感性没有相关性。
关键词 :癌,肝细胞;STAT3转录因子;病例对照研究;多态现象,遗传
Associations of signal transducer and activators of transcription 3 polymorphism with the susceptibility to hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma
XieJiaxin,GaoQiuju,YangDan,LiuTianpeng,CaoGuangwen     
Department of Preventive Medicine, Bethune Military Medical NCOs School, Shijiazhuang 050081, China
Corresponding author: Cao Guangwen, Email: gcao@smmu.edu.cn
Abstract:Objective  To evaluate the association of signal transducer and activators of transcription 3 (STAT3) -1096G/C polymorphism in promoter region with the susceptibility to HBsAg positive hepatocellular carcinoma (HCC).Methods  A total of 632 patients with HCC and 723 HBV-infected subjects without HCC treated at Changhai Hospital of Shanghai from 2009 to 2012 were included in this case-control study. The polymorphism of STAT3 -1096 G/C was genotyped by Fluorescent probe-Real time quantitative PCR. Univariate analysis was used to calculate the odds ratio (OR) and its 95% confidence interval (CI).Results  The frequency of genetic allele STAT3 -1096G/C (GC+CC) of control group and case group were 61.83% (447/723) and 60.60% (383/632), while difference of HCC risk was not found among different genotypes (OR=0.95, 95%CI: 0.76-1.18). When stratified by sex, the frequency of genetic allele STAT3 -1096C (GC+CC) of control group and case group were 62.18% (314/505) and 61.75% (331/536) in men, 61.01% (133/218) and 54.17% (52/96) in women, respectively, while difference of HCC risk was not found among different genotypes (OR=0.98, 95%CI: 0.77-1.26; OR=0.76, 95%CI: 0.47-1.26, respectively). When stratified by HBV genotypes, the frequency of genetic allele STAT3 -1096C (GC+CC) of control group and case group were 61.45% (110/179) and 53.13% (34/64) in HBV genotype B, 62.87% (276/439) and 60.27% (226/375) in HBV genotype C, respectively, while difference of HCC risk was not found among different genotypes (OR=0.71, 95%CI: 0.40-1.26; OR=0.90, 95%CI: 0.68-1.19, respectively).Conclusion  STAT3 -1096G/C polymorphism was not associated with the susceptibility to HCC for the HBV-infected subjects without HCC.
Key words :Carcinoma,hepatocellular;STAT3 transcription factor;Case-control study;Polymorphism,genetic
全文

我国肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)位居农村和城市肿瘤相关死亡的第一和第二位[1]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)慢性感染是引发HCC的最主要危险因素,我国HBV感染者占全世界的1/3,HCC发病数占全球1/2以上,HBV慢性感染及其导致的HCC已成为我国严重的公共卫生负担[1]。数据显示,世界各地华裔人群中HCC患病率普遍较高,提示HCC发生发展可能与遗传易感性有关。JAK/STAT是近年来研究较多的一条信号通路,参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等重要的生物学过程,在HCC发生发展中发挥重要作用[2,3]。信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activators of transcription3,STAT3)是该通路中的关键分子,定位于第17号染色体,其在肝癌组织中具有较高的表达水平[4],这样高表达是否与STAT3基因启动子区–1096位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)相关鲜有报道。笔者旨在通过病例–对照研究方法,探讨STAT3 –1096G/C与HBV感染者发生HCC的相关性,为筛选HCC高危人群提供有效的分子标志物。

对象与方法  

1.对象:  收集2009至2012年在上海某医院就诊的HCC、肝硬化(LC)、慢性乙型肝炎(CHB)患者和门诊体检的无症状乙肝表面抗原(HBsAg)携带者(ASCs)的全血样本5 ml。病例组纳入标准为:经病理证实的HBsAg阳性HCC患者,排除有免疫抑制治疗史、继发或转移性肝癌患者。对照组纳入标准为:HBsAg持续阳性6个月以上,或血清HBV DNA阳性的LC、CHB、ASCs,排除其他原因引起的肝炎、肝硬化等肝脏疾病(包括甲型病毒肝炎、丙型病毒肝炎、丁型病毒肝炎、戊型病毒肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎、Wilson病等)以及HIV、梅毒等其他病原体感染者。本研究通过了白求恩医务士官学校伦理审查委员会的审查。所有调查对象均通过了知情同意。

2.标本采集及模板DNA提取:  采集静脉血1 ml,EDTA抗凝。使用北京天根生化科技有限公司全血基因组DNA提取试剂盒抽提DNA,作为PCR反应模板,–40 ℃保存。

3.血清学指标、病毒载量及HBV基因型检测:  血清谷丙转氨酶(ALT)水平、乙肝e抗原(HBeAg)状态、HBVDNA滴度及HBV基因型的检测方法同前面的研究[5]

4.基因多态性检测:  采用荧光探针–实时定量PCR法对所有样本的STAT3 –1096G/C基因型进行检测。引物和探针由上海基康生物技术公司设计和合成,引物序列如下:正向引物:5′–CAAAAA TCTAAAAAGGACCCATTATCTC–3′(28 bp);反向引物:5′–CTGAACGGTCTGCATTTTCTAAAC–3′(24 bp),探针为FAM–AGCTAAGCCCTGACATAT–MGB(18 bp)和HEX–CTAACCCCTGACATAT–MGB(16 bp)。PCR反应体系总体积为20 μl,其中引物和探针各0.4 μl(10 μmol/L),premix Ex Taq 10.0 μl,模板DNA 2.0 μl。PCR反应条件为:预变性95 ℃ 10 s,45个循环(95 ℃ 10 s, 60 ℃,30 s),40 ℃ 1 s。通过收集FAM和HEX发出的不同荧光强度,获得各样本在533~580 nm和465~510 nm波段的散点分布图,便可以鉴定各样本在该多态性位点上的基因型。

5.统计学分析:  数据录入采用Excel 2003,统计分析采用SPSS 16.0软件。性别、HBeAg状态、HBV基因型、–1096G/C基因型的比较采用χ2检验。年龄的比较属正态分布,采用独立样本t检验。HBV–DNA滴度和ALT属于偏态分布,经对数转换后进行t检验,最后用非条件Logistic回归模型进行多因素分析。以Hardy–Weinberg遗传平衡定律(HWE)检验确认研究样本是否具有群体代表性。所有的统计学检验均为双侧概率检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.一般情况:  病例组的年龄、男性比例,HBV C型比例及HBeAg阴性率高于对照组(表1),而ALT水平、HBV–DNA滴度低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。

表1两组研究对象一般情况比较

2.STAT3 –1096G/C基因多态性分布:  各样本在STAT3 –1096位点的基因型鉴定如图1。GG、GC、CC、C(GC+CC)的分布在对照组和病例组之间差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

图1rs17884075基因型检测散点分布图
表2STAT3 –1096 G/C基因型分布及与HCC的患病关系

3.不同性别和HBV基因型分层的多态性分布:  将研究对象按性别进行分层以后,GG、GC、CC、C(GC+CC)的分布频率在病例组与对照组之间差异没有统计学意义(P>0.05)(表3)。将研究对象按感染HBV基因型进行分层以后,GG、GC、CC、C(GC+CC)的分布频率在病例组与对照组之间差异也没有统计学意义(P>0.05)(表4)。

表3STAT3 –1096 G/C在不同性别人群的分布及与HCC的患病关系
表4STAT3 –1096 G/C在不同HBV基因型分布及与HCC的患病关系

4.多因素分析结果:  将年龄、性别、HBV DNA滴度、HBV基因型及STAT3 –1096G/C基因多态性等可能与HCC相关的因素纳入非条件Logistic回归模型进行多因素分析,发现HBV基因型C、HBeAg阴性是HCC的独立危险因素,但是STAT3 –1096G/C基因多态性与HCC没有相关性(P值均>0.05)。

讨论  炎症在HBV致癌和预后方面起重要作用,STAT3作为重要炎症信号通路JAK/STAT中的关键分子,其基因多态性可能与HCC的发生相关。个体感染HBV后的结局包括无症ASCs、CHB、LC、HCC。因此,笔者以未发生HCC的HBV感染者(ASCs、CHB、LC)作为对照组,以HBsAg阳性HCC作为病例组,研究STAT3基因多态性与HBV阳性HCC的相关性。本研究中,病例组平均年龄、男性比例,HBV C型比例及HBeAg阴性率均高于对照组,而HBV DNA滴度和ALT水平在病例组与对照组间差异无统计学意义,与笔者前期研究结果一致[6]
        通过对转录因子结合位点进行预测,当STAT3启动子区–1096为G时,该位点为转录因子ADR1、STRE的结合区域,而当该位点为C时,便失去了与ADR1、STRE的结合,成为转录因子USF的结合位点,因此,该多态性可能影响STAT3启动子与相应转录因子的结合,从而改变STAT3的基因转录水平。但是,笔者发现GG、GC、CC三种基因型的分布在对照组和病例组之间差异没有统计学意义,该多态性可能与HBV阳性HCC的发生没有相关性。
        笔者前期研究发现,STAT3基因某些位点多态可能会导致男、女性患HCC的风险不同,如rs2293152 GG基因型增加女性HBV感染者发生HCC的风险,但是在男性中与HCC的发生没有相关性,提示可能与不同性别导致的遗传环境差异有关[6,7],因此,本研究中,笔者将研究对象按性别进行分层以后分析STAT3 –1096G/C多态性与HCC发生的相关性,在女性中,CC基因型频率在HCC组(8.4%)低于对照组(16.0%),与GG基因型比较,其OR为0.44(95%CI:0.19~1.03, P=0.055),差异无统计学意义,但是由于本次研究中女性较少,可以在更大样本量的研究中评价携带STAT3 –1096 CC基因型是否可以降低女性HBV感染者发生HCC的风险。不同HBV基因型病毒具有不同的变异谱,与疾病临床进展、预后以及对抗病毒药物的反应相关[8,9],笔者前期研究发现,STAT3基因多态性与HBV基因变异在HCC发生中存在交互作用[6],本研究中,笔者分别在HBV B型和C型感染者中分析STAT3 –1096G/C多态性与HCC发生的相关性,但是差异均没有统计学意义,提示在B型或C型HBV感染者中,该基因多态性与HCC没有相关性(P>0.05)。

参考文献
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[3]张虹, 王敏, 刘伟, 等. 肝癌细胞中STAT3及c–myc的表达及其意义[J]. 肿瘤, 2008, 28(5):394–397.
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