中华预防医学杂志    2014年08期 湖南省动物源性食品中沙门菌流行特征分析    PDF     文章点击量:4668    
中华预防医学杂志2014年08期
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贾华云 高立冬 郭云昌 李薇薇 王岚 陈帅 张红
JiaHuayun,GaoLidong,GuoYunchang,LiWeiwei,WangLan,ChenShuai,ZhangHong
湖南省动物源性食品中沙门菌流行特征分析
Epidemiological characteristics of Salmonella in animal source foods in Hunan
中华预防医学杂志, 2014,48(8)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.08.010
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投稿日期: 2014-06-02
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湖南省动物源性食品中沙门菌流行特征分析
贾华云 高立冬 郭云昌 李薇薇 王岚 陈帅 张红     
贾华云 410005 长沙,湖南省疾病预防控制中心 湖南省微生物分子生物学重点实验室
高立冬 410005 长沙,湖南省疾病预防控制中心 湖南省微生物分子生物学重点实验室
郭云昌 国家食品安全风险评估中心食源性疾病监测部
李薇薇 国家食品安全风险评估中心食源性疾病监测部
王岚 410005 长沙,湖南省疾病预防控制中心 湖南省微生物分子生物学重点实验室
陈帅 410005 长沙,湖南省疾病预防控制中心 湖南省微生物分子生物学重点实验室
张红 410005 长沙,湖南省疾病预防控制中心 湖南省微生物分子生物学重点实验室
摘要: 目的  研究湖南省动物源性食品中沙门菌的分子流行病学特征。方法  2010年在湖南省10个市的集贸市场和超市,按照无菌采样原则采集畜肉159份、禽肉152份,动物性水产品381份,共计692份样品,分离沙门菌,进行血清、耐药表型和PFGE分子分型。结果  692份动物源性食品中,93份样品检出沙门菌,检出率为13.4%,禽肉、畜肉和水产品中沙门菌检出率分别为23.0%(35/152),22.6%(36/159)和5.8%(22/381),水产品中沙门菌检出率低于禽肉和畜肉(χ2值分别为33.86、33.29, P值均<0.05)。分离菌株血清型呈多样化分布,优势血清型为德尔卑沙门菌,占35.1%(33/94)。79.8%(75/94)的菌株至少对一种抗生素耐药,31.9%(30/94)的菌株对5种以上抗生素耐药,呈多重耐药性,禽、畜肉中分离菌株的多重耐药率分别为47.2%(17/36)和22.2%(8/36),禽肉分离的多重耐药菌株高于畜肉(χ2=4.96, P<0.05)。试验菌株对四环素的耐药率最高,达62.8%(59/94)。PFGE分型可以分为69个PFGE型,优势型为7型(6株)、15型(4株)和22型(6株)。结论  湖南省动物源性食品沙门菌污染严重,且菌株耐药形势严峻,PFGE分型结果提示可能存在沙门菌流行株。
关键词 :沙门菌属;电泳,凝胶,脉冲场;食品污染;动物源性食品;药敏试验
Epidemiological characteristics of Salmonella in animal source foods in Hunan
JiaHuayun,GaoLidong,GuoYunchang,LiWeiwei,WangLan,ChenShuai,ZhangHong     
Hunan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Key Laboratory of Microbial Molecular Biology of Hunan Province, Changsha 410005, China
Corresponding author: Zhang Hong, Email: 931525821@qq.com
Abstract:Objective  To study the molecular epidemiological characteristics of Salmonella in animal source foods in Hunan.Methods  The fair trade markets and supermarkets of ten cities were chosen to sample animal source foods for isolating Salmonella in Hunan province in 2010. A total of 692 samples were collected by aseptic sampling, included 159 livestock meats, 152 poultry meats, and 381 aquatic products.Salmonella strains isolated were subjected to stereotyping, antimicrobial susceptibility testing and pulsed field gel electrophoresis (PFGE).Results  Salmonella was detected in 93 of 692 animal food samples with the detection rate of 13.4%. The detection rates of Salmonella in poultry meats, livestock meats and aquatic products were 23.0% (35/152), 22.6% (36/159) and 5.8% (22/381) respectively. Therefore, the detection rate in aquatic products was lower than that of poultry meats and livestock meats (χ2=33.86, P<0.05; χ2=33.29, P<0.05, respectively). The serotypes of isolates showed diversity, and Salmonella Derby (33/94, 35.1%) was the predominant serotypes.79.8% (75/94) strains showed resistant to more than one antibiotic used in the test, 31.9% (30/94) strains showed resistant to more than 5 antibiotics. A significant difference was observed for multidrug resistance between Salmonella isolated from poultry (47.2%, 17/36) and livestock meats (22.2%, 8/36) (χ2=4.96, P<0.05). And the highest resistant rate was found in tetracycline, as high as 62.8% (59/94). All the strains were divided into 69 PFGE subtypes. Furthermore the dominating subtypes were type 7 (6 strains), type 15 (4 strains), type 22 (6 strains).Conclusion  Inspection results showed that Salmonella contamination in animal source foods were serious in Hunan province, and the isolates expressed high level resistance to the antibiotics. Furthermore the PFGE results indicated that there were epidemic strains of Salmonella in Hunan.
Key words :Salmonella;Electrophoresis,gel,pulsed-field;Food contamination;Animal source foods;Antibiotic susceptibility test
全文

美国每年约有上百万人因食用沙门菌污染的食品而引起肠热症、胃肠炎和败血症等疾病[1]。WHO全球沙门菌监测(GSS)显示,95%以上的食源性沙门菌感染是由动物源性食品引起。我国非伤寒沙门菌感染性腹泻病例的血清型较多,以鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌为优势血清型[2]。因此,笔者对湖南省动物源性食品中的沙门菌污染状况、优势血清型、抗生素耐药性以及PFGE分子分型进行了研究,为科学防控沙门菌所致腹泻或暴发提供决策依据。

材料与方法  

1.样品采集:  2010年在湖南省长沙、株洲、湘潭等10个市的集贸市场和超市,以各市的人口数量分层设置采样点,从采样点的零售食品中抽样,按照无菌采样原则共采集畜肉159份、禽肉152份,动物性水产品381份,共计692份样品,于4 ℃下6~8 h运送至实验室进行检测。

2.培养基与试剂:  缓冲蛋白胨水,四硫磺酸钠亮绿(TTB)、亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液,亚硫酸铋琼脂(BS)、Hektoen Enteric琼脂(HE)培养基(北京陆桥技术有限责任公司);API 20E生化试剂盒(法国生物梅里埃公司);沙门菌诊断血清(泰国S&A公司);药敏试剂盒(天津金章科技发展有限公司);SeaKem Gold琼脂糖,10×三羟甲基氨基甲烷–硼酸盐–乙二胺四乙酸二钠(TBE)缓冲液(美国Bio–Rad公司);蛋白酶K(美国Sigma公司);限制性内切酶Xba I[宝生物工程(大连)有限公司];药敏实验用质量控制菌株大肠埃希菌ATCC 25922,PFGE相对分子量标准用沙门菌H9812,均由国家食品安全风险评估中心赠送。

3.分离培养及鉴定:  样品的检测参照GB/T 4789.4–2008进行,所有样品在缓冲蛋白胨水36 ℃增菌18 h,然后分别使用TTB和SC增菌液二次增菌18 h后,于BS琼脂和HE琼脂平板36 ℃分离培养24 h,挑取可疑菌落经初步生化,使用API 20E进行生化鉴定。沙门菌的血清型鉴定按照泰国S&A公司提供的沙门菌血清诊断操作步骤进行,根据测定得到的抗原式确定沙门菌的血清型。

4.药敏试验:  采用微量肉汤稀释法测定抗生素的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),包括下列抗菌药物:阿莫西林–克拉维酸(AMC),阿米卡星(AMK),氨苄青霉素(AMP),氯霉素(CHL),环丙沙星(CIP),头孢曲松(CRO),头孢噻肟(CTX),头孢吡圬(FEP),庆大霉素(GEN),卡那霉素(KAN),萘啶酸(NAL),磺胺嘧啶(SDI),复方磺胺甲唑(SXT),四环素(TET),结果判断参照美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)出版的药物敏感试验指南[3]

5.PFGE:  PFGE分型按照美国CDC推荐的分型方案进行。沙门菌经琼脂糖固定、蛋白酶K裂解、洗涤后,包埋的DNA在37 ℃水浴中使用40 U的Xba I酶切至少2 h。得到的DNA片段使用Chef Mapper脉冲场凝胶电泳分型,电泳缓冲液为0.5×TBE,电泳时间为19 h,电泳温度为14 ℃,脉冲时间为2.16~63.8 s。凝胶使用GelRed染色后成像。

6.统计学分析:  应用SPSS 13.0软件对不同类别的动物源性食品中沙门菌的分离率和耐药性进行χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。使用BioNumerics 6.6软件处理PFGE成像结果,采用组间非加权的几何平均数(unweighted pair group method using arithmetic averages, UPGMA)方法进行聚类分析,采用基于条带比较的Dice系数衡量PFGE带型之间的相似度,相似度为100%被视为同一PFGE型。

结果  

1.沙门菌检出情况:  共采集样本692份,93份样品中检出94株沙门菌,总体检出率为13.4%。152份禽肉有35份样品检出36株沙门菌,检出率为23.0%;畜肉中沙门菌检出率为22.6%(36/159);水产品中沙门菌检出率为5.8%(22/381);不同类别动物源性食品中沙门菌检出率差异有统计学意义(χ2=42.83, P<0.05),水产品中沙门菌的检出率低于禽肉和畜肉,差异有统计学意义(χ2值分别为33.86、33.29, P值均<0.05)。

2.血清分型结果:  除1株沙门菌未能分型外,其余93株沙门菌经血清型鉴定,共分属28个血清型,以德尔卑沙门菌为主(S. Derby),占35.1%,其次为鼠伤寒沙门菌(S. Typhimurium ),占6.4%。畜肉中检出8个血清型,以德尔卑沙门菌为优势血清型,占72.2%,其余血清型则只检出1~2株;禽肉中检出18个血清型,血清型表现为多样性,优势血清型相对不明显;水产品的12个血清型与禽畜肉的血清型有一定区别,有6个血清型在禽肉和畜肉中都未检出,具体结果见表1

表1湖南省动物源性食品中沙门菌血清型分布情况

3.药敏试验结果:  14种抗生素敏感性试验表明,79.8%(75/94)的菌株至少对14种抗生素中的1种抗生素耐药。不同来源的沙门菌对14种抗生素的敏感程度不同,水产品中分离的沙门菌对14种抗生素较禽、畜肉中的分离株敏感,差异有统计学意义(χ2值分别为8.79、5.66, P值均<0.05)。多重耐药分析结果表明,31.9%的沙门菌(30/94)至少对5种以上抗生素耐药,主要对青霉素、四环素和磺胺类抗生素耐药,禽、畜肉分离菌株的多重耐药率分别为47.2%(17/36)和22.2%(8/36)。且对10种以上抗生素耐药的菌株都分离自禽肉,禽肉分离的多重耐药沙门菌高于畜肉,差异有统计学意义(χ2=4.96, P<0.05)。见表2

表2湖南省动物源性食品中沙门菌的耐药情况
14种抗生素中,试验菌株对四环素的耐药率最高,达62.8%(59/94);其他依次为阿莫西林–克拉维酸(43/94,45.7%)、氯霉素(39/94,41.5%)、磺胺嘧啶(37/94,39.4%),复方磺胺甲唑(35/94,37.2%)、氨苄青霉素(33/94,35.1%)和萘啶酸(30/94,31.9%)。不同食品中分离的沙门菌对不同抗生素的耐药性有差别,其中分离于禽肉的沙门菌对氨苄青霉素、萘啶酸的耐药性高于畜肉分离株,差异有统计学意义(χ2值分别为3.85、4.96, P值均<0.05);分离于禽肉的沙门菌对阿莫西林–克拉维酸、磺胺嘧啶、复方磺胺甲唑和四环素的耐药性高于水产品分离株,差异有统计学意义(χ2值分别为6.26、5.08、12.52、6.09, P值均<0.05);分离于畜肉的沙门菌对氯霉素、复方磺胺甲唑和四环素的耐药性高于水产品分离株,差异有统计学意义(χ2值分别为5.08、5.20、7.24, P值均<0.05)。见表3
表3湖南省动物源性食品中沙门菌对14种抗生素的耐药率(%)

4.PFGE实验结果:  除1株鼠伤寒沙门菌DNA降解未能获得图谱外,其余93株沙门菌的PFGE图谱可以分为69个PFGE型,表现较大的遗传多样性,优势型为7型(6株)、22型(6株)和15型(4株),见图1

图1湖南省动物源性食品中沙门菌PFGE及抗生素耐药图谱

讨论  本研究结果表明,动物源性食品中沙门菌检出率为13.4%,其中禽、畜肉样品沙门菌检出率分别为23.0%和22.6%,与河南、江苏等省鸡肉中沙门菌检出情况相似[4]。中国引起食源性疾病的沙门菌血清型较多,以肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌为主[5,6],而食品中的沙门菌血清型主要有德尔卑沙门茵、阿贡纳沙门茵、肠炎沙门菌、里定沙门菌[7]。湖南省食品中沙门菌的优势血清型与周边省份的研究结果一致,江西[8]、广西[9]、广东[10]和湖南省均以德尔卑沙门菌和鼠伤寒沙门菌为主。
        与美国国家抗生素耐药性监测网系统(NARMS)监测数据相比,本研究中沙门菌呈现出较高的耐药率。这可能是由于本研究中菌株分离自动物源性食品,NARMS监测菌株主要分离自患者。本研究中,50.0%鼠伤寒沙门菌对5种以上抗生素耐药,与Ahmed等[11]对动物源鼠伤寒沙门菌的耐药研究结果基本一致,耐药谱与国外暴发流行的超级耐药鼠伤寒沙门菌DT104相似,对氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺类、四环素等抗生素耐药,但菌株对头孢类抗生素均敏感,故临床用药推荐使用头孢类抗生素。
        PFGE与血清型分析结果表明,具有相同血清型的菌株可获得相同或不同的PFGE型,具有相同PFGE型的沙门菌血清型并不一定相同,不同血清型的沙门菌也可能有较高的基因同源性,这和梅玲玲等[12]对沙门菌PFGE分型的研究结果研究一致。在不同地区从不同食品中分离的沙门菌,有些亲缘关系远近不同,且存在一些优势PFGE型,提示湖南省可能存在着流行株和非流行株。如PFGE 7型的6个菌株分别分离于益阳、株洲、湘潭的禽肉或者畜肉中,菌株间的遗传相似度非常高,这些菌株之间可能存在联系。
        PFGE型与耐药试验结果相结合分析认为,某些具有相同PFGE型别的菌株,其耐药表型可能不同(如PFGE 1型、7型和15型),这可能因为细菌的耐药基因主要位于质粒上,而PFGE分型是对细菌基因组DNA进行酶切分析。在相同血清型菌株中,具有相同耐药表型的菌株比耐药表型不同的菌株亲缘关系更近,这和Zhao等[13]和Roberto等[14]分别对纽波特沙门菌(S. Newport)和肯塔基沙门菌(S. Kentucky)的研究相似。同时研究发现某些菌株的PFGE型相同,如PFGE 22型的菌株,分别分离于株洲、长沙、常德的禽肉中,而且这些菌株的耐药表型亦相同或相似,菌株可能有相同来源。因此,建议加强沙门菌监测和流行病学调查,揭示潜在的传染源和传播途径,以防控沙门菌病的暴发。

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