中华预防医学杂志    2014年08期 核糖基化在六价铬致细胞损害中的作用机制探讨    PDF     文章点击量:3298    
中华预防医学杂志2014年08期
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李绚 蔡剑锋 庄志雄 刘建军 夏菠 胡恭华 李习艺 黄海燕
核糖基化在六价铬致细胞损害中的作用机制探讨
中华预防医学杂志, 2014,48(8)
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核糖基化在六价铬致细胞损害中的作用机制探讨
李绚 蔡剑锋 庄志雄 刘建军 夏菠 胡恭华 李习艺 黄海燕     
摘要: 目的探讨聚ADP核糖基化在Cr(Ⅵ)致细胞损害中的作用。方法选用前期建立的聚ADP核糖水解酶(PARG)缺陷的人支气管上皮细胞(16HBE细胞)作为研究对象,选用不同剂量的Cr(Ⅵ)分别染毒,并处理正常16HBE细胞和PARG缺陷细胞24 h,同时设立溶剂对照组,比较两种细胞对Cr(Ⅵ)毒作用的差异;在此基础上,选取50 μmol/L的 Cr(Ⅵ)作为染毒剂量,染毒处理两种细胞后,提取细胞总蛋白进行双向荧光差异凝胶电泳(2DDIGE)分析,计算比较两种细胞染毒前、后的总蛋白表达差异,对差异蛋白点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDITOFMS/MS)鉴定,并进一步使用Western blot验证。 结果Cr(Ⅵ)作用后,PARG缺陷细胞的存活较正常16HBE细胞多,当作用剂量达到50 μmol/L时,16HBE 细胞和PARG 缺陷细胞的存活率分别为(5967±643)%和(8200±625)%,两者之间的差异有统计学意义(t=-432,P<005);2DDIGE分析比较正常16HBE细胞与PARG缺陷细胞Cr(Ⅵ)染毒前、后蛋白差异,共筛选且成功鉴定出18个蛋白,这些蛋白的功能涉及维持细胞形态、参与能量代谢、DNA损伤修复以及基因表达调控。Western blot成功验证出差异表达蛋白cofilin1,其在染毒后的16HBE细胞中表达上调,相对表达量为141±004,对照组表达量为100±001,差异有统计学意义(t=-1800, P<005)。在PARG缺陷细胞表达差异无统计学意义(t=-861,P>005)。 结论鉴定出的差异蛋白大多与肿瘤发生密切相关,推测聚ADP核糖基化反应可通过抑制Cr(Ⅵ)诱导的肿瘤发生从而对抗Cr(Ⅵ)的细胞毒性,这为阐明聚ADP核糖基化在Cr(Ⅵ)致细胞损害中的作用机制提供了重要的参考依据。
关键词 :铬;细胞;聚ADP核糖基化;双向荧光差异凝胶电泳;人支气管上皮细胞
    
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of polyADPribosylation in hexavalent chromium Cr(Ⅵ) induced cell damage MethodsThe study object, poly (ADPribose) glycohydrolase (PARG) deficient human bronchial epithelial cells (16HBE cells), was constructed previously by our research group Normal 16HBE cells and PARGdeficient cells were treated with different doses of Cr (Ⅵ) for 24 h to compare the differences to Cr (Ⅵ) toxicity, meanwhile set up the solvent control group On this basis, 50 μmol/L of Cr (Ⅵ) was selected as the exposure dose, after the exposure treatment, total proteins of both cells were extracted for two dimension fluorescence difference gel electrophoresis (2DDIGE) separation, statistically significant differential protein spots were screened and identified by matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDITOFMS/MS), and further validated by Western blot ResultsAfter Cr (Ⅵ) treatment, the survival rate of PARGdeficient cells was higher than normal 16HBE cells When the doses reached up to 50 μmol/L, the survival rate of 16HBE cells and PARGdeficient cells were respectively (5967±643)% and (8200±625)%, the difference between which was significant (t=-432,P<005) 18 protein spots were selected and successfully identified after 2DDIGE comparison of differential proteins between normal 16HBE cells and PARGdeficient cells before and after exposure The function of those proteins was involved in the maintenance of cell shape, energy metabolism, DNA damage repair and regulation of gene expression The differential expression of cofilin1 was successfully validated by Western blot The expression level of cofilin1 in the 16HBE cells increased after Cr (Ⅵ) exposure with the relative expression quantity of 141±004 in treated group and 100±001 in control group, the difference of which was statistically significant (t=-1800, P< 005),while the expression level in PARGdeficient cells had no statistically significant difference(t=-861,P>005) ConclusionMost of the identified differential proteins are closely related to tumorigenesis, suggesting that polyADPribosylation reaction may resist the cytotoxicity of Cr(Ⅵ) by inhibiting Cr (Ⅵ) induced tumorigenesis, which provides important reference data to clarify the mechanisms of polyADPribosylation in Cr (Ⅵ) induced cell damage
Key words :Chromium;Cells;PolyADPribosylation;Twodimensional fluorescence difference gel electrophoresis;16HBE cells
全文

聚ADP核糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,该反应在聚ADP核糖聚合酶(PARP)催化下,将聚ADP核糖多聚体(PAR)共价连接到受体蛋白上去,PARP通过聚ADP核糖基化这一过程影响这些受体蛋白的功能,参与一系列重要的生命活动,如染色质的功能与调节、肿瘤的发生、细胞发育、细胞分化与信号转导、程序性细胞死亡等[1]。聚ADP核糖水解酶(PARG)主要负责水解蛋白受体上大部分ADP核糖单元,PARP与PARG的活性平衡维持着细胞内聚ADP核糖基化的水平,从而保持受体蛋白活性的稳定[2]。六价铬[Cr(Ⅵ)]被广泛地应用于工业生产,是一种常见的重金属污染物,诸多研究显示其对生物体具有多种毒性,如肝肾毒性、生殖毒性、遗传毒性、致癌性等[34],1990 年被国际癌症研究中心(IARC)确认为人类致癌物。有研究显示,Cr(Ⅵ)所致癌症涉及多种蛋白、细胞通路的改变,而聚ADP核糖基化参与执行各种生物事件同样涉及多蛋白和多网络的共同调控[5]。因此,笔者应用双向荧光差异凝胶电泳(2DDIGE)技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDITOFMS/MS)技术识别和鉴定Cr(Ⅵ)对人支气管上皮细胞(16HBE细胞)毒性中PARG功能相关的蛋白,为阐明聚ADP核糖基化在Cr(VI)致细胞损害中的作用机制提供线索和参考依据。
材料与方法
1.试剂与仪器:(1)试剂:差异凝胶电泳(DIGE)染料、2D Quant Kit、Immobile胶条(pH 311,24 cm)、IPG buffer(pH 311)、硫脲、尿素(美国GE Healthcare公司),Tris、3[(3胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、碘乙酰铵(IAA)、二硫苏糖醇(DTT)、碳酸氢铵、三氟乙酸(美国Sigma公司),TEMED、30%丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺溶液(体积比29∶1,美国BioRad公司),过硫酸铵、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate(美国Thermo公司),十二烷基磺酸钠(SDS,美国Affymetrix公司),色谱级丙酮(美国DINOX公司),低熔点琼脂糖(美国Invitrogen公司),基质、肽标准品(德国Bruker公司),胰酶(美国Promega公司), 细胞死亡ELISA检测试剂盒(德国Roche公司),鼠单克隆甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(sc32233)、鼠单克隆丝切蛋白1(cofilin1)抗体(sc53934)、羊抗鼠HRP二抗(sc2005,美国Santa Cruz公司)。(2)仪器:M1000型全自动酶标仪(瑞士TECAN公司),Ettan IPGphor 3等电聚焦系统、Ettan DALTsix电泳系统、Typhoon Trio多功能激光扫描成像系统(美国GE Healthcare公司),超声破碎仪(美国SONICS公司),超声清洗仪(美国BRANSON公司),基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(UltrafleXtreme型,德国Bruker公司)。
2.受试细胞及染毒:16HBE细胞(由深圳市CDC保存),PARG基因缺陷16HBE细胞株为笔者课题组前期构建[6](以下简称PARG缺陷细胞),细胞受试物为铬酸钾(美国Sigma公司),当细胞融合度达80%左右时,用无血清MEM培养基将Cr(Ⅵ)分别稀释至03、06、12、25、50 μmol/L进行细胞染毒。
3.细胞存活率检测:使用罗氏细胞死亡ELISA检测试剂盒进行细胞死亡分析,将细胞接种于96孔板,染毒细胞24 h,染毒结束后在200×g离心96孔板10 min,去掉上清,加入裂解缓冲液,室温孵育30 min,再次200×g离心96孔板10 min。将上清转移至链霉素包被板,并向上清中加入含DNA抗体和组蛋白抗体的免疫试剂,室温孵育2 h。使用孵育液清洗3次,加入显色液,室温孵育约15 min。全自动酶标仪检测吸光度值(A值,测定波长为450 nm)。计算细胞存活率,存活率(%)=(处理组A值-对照组A值)/(对照组A值)×100%。
4.蛋白质组学分析和差异蛋白质的鉴定:(1)总蛋白提取与纯化:选取3个批次的细胞,培养至融合度为80%时,进行Cr(Ⅵ)处理,剂量50 μmol/L,无血清培养基作为对照。培养24 h后,用细胞裂解液(7 mol尿素、2 mol硫脲、质量分数为4%CHAPS、30 mmol Tris)提取总蛋白,丙酮沉淀,适量裂解液重悬,蛋白定量。样品于-80 ℃保存。(2)2DDIGE:采用最小标记法(200 pmol染料/25 μg蛋白质),对样品进行正反标记(表1),各组样品取等量混合后用荧光染料Cy2标记作为每块凝胶的内标。将3种不同染料标记的样品混合后后置IPGphor等电聚焦仪聚焦(条件:30 V 12 h,100 V 1 h,300 V 1 h,500 V 1 h,1 000 V 1 h,8 000 V至总聚焦10 000 Vh),胶条平衡后转丙烯酰胺质量分数为125% 的SDSPAGE凝胶电泳分离。(3)凝胶图像的采集与分析:电泳后的凝胶使用Typhoon Trio多功能激光扫描成像系统进行扫描成像,使用DeCyderTM 2D Differential Analysis Software V65软件分析,找出蛋白表达差异点。(4)MALDITOFMS/MS分析及数据库检索:2DE凝胶考马斯亮蓝染色后切取差异蛋白点,胶粒经脱色和脱水处理,胰酶37 ℃酶切过夜,MALDITOF串联质谱采集数据,MASCOT检索,数据库为Swissprot,人种选择智人(Homo sapiens),一级谱质量误差05 Da,二级谱质量误差01 Da。根据检测结果于Uniprot数据库搜索得各蛋白功能。

表1样品分组及标记方案
编号荧光染料Cy2荧光染料Cy3荧光染料Cy51内标HCaP5c2内标P5aHCb3内标HCcP5b4内标H5aPCc5内标PCaH5b6内标H5cPCb注:HC为16HBE细胞溶剂对照组,PC为PARG缺陷细胞溶剂对照组,H5为16HBE细胞50 μmol/L Cr(Ⅵ)染毒组,P5为PARG缺陷细胞50 μmol/L Cr(Ⅵ)染毒组;a、b、c分别为各组细胞的生物学重复

5.Western blot 验证差异蛋白:提取细胞总蛋白并定量,用丙烯酰胺质量分数为10%的SDSPAGE凝胶电泳,将蛋白转至PVDF膜,一抗孵育后,加入HRP标记二抗,ECL显影。用GE公司的ImageQuant TL软件分析各条带灰度值,以GAPDH为内参。
6.统计学分析:采用DeCyderTM 2D Differential Analysis Software V65软件进行差异蛋白表达水平的统计分析,包括Cr(Ⅵ)染毒与PARG缺陷间的双因素分析,16HBE细胞染毒组与对照组、PARG缺陷细胞染毒组与对照组以及两种细胞的染毒组间的t检验。采用SPSS 170 软件对细胞存活率和cofilin1的表达水平进行统计分析,各实验至少重复3次,结果以±s表示,细胞存活率和cofilin1的相对表达量均属于正态分布,不同染毒剂量组间均数比较采用方差分析,16HBE细胞组与PARG缺陷细胞组间均数比较采用t检验,以P<005为差异有统计学意义。
结果
1.两种细胞Cr(Ⅵ)作用后细胞存活率的比较:使用罗氏细胞死亡ELISA检测试剂盒检测细胞的存活率,发现两种细胞对Cr(Ⅵ)作用的反应存在差异,Cr(Ⅵ)作用后,PARG缺陷细胞的存活较正常16HBE细胞多,当作用剂量达到50 μmol/L时,两者之间的差异有统计学意义(P<005),见表2。

表2两种细胞Cr(Ⅵ)染毒24 h后细胞
存活率的比较(±s,%,n=3)
染毒剂量(μmol/L) 16HBE细胞 PARG缺陷细胞对照组 10067±503 10000±26503 9533±351 9733±40406 9233±493 9400±43612 8867±404 9200±52925 8300±436a 8867±64350 5967±643b 8200±625acF值 2725494P值<001<001注:16HBE细胞:人支气管上皮细胞;PARG:聚ADP核糖水解酶;a与对照组比较,P<005;b与对照组比较,P<001;c与16HBE细胞比较,P<005

2.Cr(Ⅵ) 作用细胞后差异蛋白点的筛选与鉴定:双向电泳后,获得分辨率较高、重复性良好的6张蛋白质凝胶图(图1)。用DeCyder DIA软件分析发现每块凝胶平均含有(1 316±77)个蛋白点,以点数最多的凝胶的Cy2的图像为标准,其他图谱与之匹配,匹配率约为8116%。用DeCyder BVA软件分析蛋白质表达量差异,挑选出差异蛋白点进行质谱鉴定,确定了18个蛋白(表3)。其中,Cr(Ⅵ)染毒与PARG缺陷间存在交互作用(P<005)的有蛋白点357、385、512、596、624、894、930、1023、1269、图为经Typhoon Trio扫描仪多通道扫描重叠后的蛋白图谱,其中绿色的点代表Cy3标记的16HBE细胞溶剂对照组表达量高的蛋白,红色的点代表Cy5标记的PARG缺陷细胞50 μmol/L Cr(Ⅵ)染毒组表达量高的蛋白,白色的点代表在两组间无差异表达的蛋白;图中数字为差异蛋白点索引号;16HBE细胞:正常人支气管上皮细胞;PARG:聚ADP核糖水解酶;2DDIGE:双向荧光差异凝胶电泳
图1Cr(Ⅵ)染毒16HBE细胞和PARG缺陷细胞24 h的2DDIGE图谱
表3串联质谱鉴定结果及差异蛋白相对表达量
蛋白点
索引号蛋白名称登录号功能相对分子质
量/等电点搜库
得分蛋白表达量比P5/H5H5/HCP5/PC交互作用
P值a357埃兹蛋白EZRI_HUMAN细胞骨架蛋白69 484/59155122--001385线粒体热休克蛋白75TRAP1_HUMAN伴侣蛋白、能量代谢80 345/90115--187-004512磷酸化应激诱导蛋白STIP1_HUMAN伴侣蛋白、能量代谢63 227/6453-124--003596翻译起始因子4AIIF4A1_HUMAN基因表达调控46 353/52132---138005604丙酮酸激酶KPYM_HUMAN能量代谢58 411/87112-159--006624T复合蛋白1β亚基TCPB_HUMAN伴侣蛋白、能量代谢57 794/60230-127--002668解螺旋酶RuvBRUVB1_HUMANDNA损伤修复50 538/6058-145--036714α烯醇酶ENOA_HUMAN能量代谢47 481/77320--233-00576226s蛋白酶体调节亚基8PRS8_HUMAN伴侣蛋白45 785/8764-177--030894多聚胞嘧啶结合蛋白1PCBP1_HUMAN基因表达调控37 987/68106119-128-<001919醛缩酶AALDOA_HUMAN能量代谢39 706/9268166--052930果糖二磷酸醛缩酶AALDOA_HUMAN能量代谢39 851/9290--120-<0011023不均一性核糖核蛋白H3HNRH3_HUMAN基因表达调控36 960/64128-145-0021153内质网驻留蛋白29ERP29_HUMAN伴侣蛋白29 032/75122121-1170121269过氧化物酶1PRDX1_HUMAN氧化应激22 324/92201211-122-0031293线粒体ATP合成酶d亚基ATP5H_HUMAN能量代谢18 537/51166129--0031322丝切蛋白1COF1_HUMAN细胞骨架蛋白18 719/9182-165213-0091342肽酰脯氨酰顺反式异构酶APPIA_HUMAN伴侣蛋白18 229/90200--279-001注:HC为16HBE细胞溶剂对照组,PC为PARG缺陷细胞溶剂对照组,H5为16HBE细胞50 μmol/L Cr(Ⅵ)染毒组,P5为PARG缺陷细胞50 μmol/L Cr(Ⅵ)染毒组,“-”表示差异无统计学意义,a Cr(Ⅵ)染毒与PARG缺陷间的交互作用1 293和1 342,表明Cr(Ⅵ)作用过程中,PARG可影响这些蛋白的表达。此外,Cr(Ⅵ)染毒后,正常细胞表达高于缺陷细胞表达的蛋白有:磷酸化应激诱导蛋白(STIP1)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase)、T复合蛋白1β亚基(TCPB)、解螺旋酶RuvB(RuvB1)、26s蛋白酶体调节亚基8(PRS8)、丝切蛋白1(cofilin1);正常细胞表达低于缺陷细胞的蛋白有:埃兹蛋白(ezrin)、多聚胞嘧啶结合蛋白1(PCBP1)、醛缩酶A(aldolase A)、内质网驻留蛋白29(ERP29)、过氧化物酶1(Prdx1)、线粒体ATP合成酶d亚基(ATP5H)。
3.Western blot验证:通过Western blot分析cofilin1的蛋白表达水平,验证2DDIGE分析(图2)的数据。结果发现:正常16HBE细胞Cr((Ⅵ))染毒后,cofilin1的表达水平提高,其中对照组为100±001,染毒组为16HBE细胞:正常人支气管上皮细胞;PARG:聚ADP核糖水解酶;图中峰代表蛋白的表达量最高值,黑色区域代表表达量的计算区域
图2双向荧光差异凝胶电泳分析Cr(Ⅵ)染毒24 h后cofilin1蛋白在两种细胞内表达的三维图
141±004,差异有统计学意义(t=-1800 P<005);PARG缺陷细胞Cr(Ⅵ)染毒后,cofilin1的表达无改变,其中对照组为101±001,染毒组为109±001,差异无统计学意义(t=-861,P>005)。该结果与2DDIGE的分析结果基本一致。
 讨论
   Cr(Ⅵ)已被证实能引起肺癌[7],肺癌起源于支气管上皮或肺泡上皮细胞,故选取16HBE细胞作为研究对象,能较好了解Cr(Ⅵ)的毒作用。通过比较分析正常16HBE细胞和PARG缺陷细胞Cr(Ⅵ)处理后的细胞存活情况,结果发现Cr(Ⅵ)对16HBE细胞有明显的毒作用,而PARG缺陷细胞能明显减少Cr(Ⅵ)作用后的细胞死亡,同时课题组前期研究发现,PARG缺陷细胞可对抗Cr(Ⅵ)刺激所诱导的基因组甲基化水平降低[8],由此表明聚ADP核糖基化可能拮抗Cr(Ⅵ)对16HBE细胞的损伤作用。
本研究联合应用2DDIGE和MALDITOFMS/MS技术识别和鉴定了Cr(Ⅵ)染毒前后16HBE细胞和PARG缺陷细胞的18个差异蛋白,功能涉及维持细胞形态、参与能量代谢、DNA损伤修复以及基因表达调控等,其中,Prdx1和ATP5H在Cr(Ⅵ)染毒后的PARG缺陷细胞内出现明显的表达增加,TCPB则表达减少。Prdx1是负责清除活性氧的过氧化物氧化还原酶家族的一员,在氧化应激状态下核因子Nrf2与prdx1基因启动子近端和远端的亲电体效应元件结合,上调其表达[9]。Cr(Ⅵ)可通过SO2-4 / HPO2-4离子通道进入细胞并产生大量活性氧(ROS),引起细胞DNA损伤及癌变[10]。该蛋白在经Cr(Ⅵ)染毒的PARG缺陷细胞表达增加,推测PARG缺陷细胞通过调节该蛋白的活性,对抗ROS的毒作用,从而对细胞产生保护作用。ATP5H是线粒体内膜上ATP合酶的一个亚基。有毒化学物的暴露能抑制细胞内ATP的生成,同时毒物刺激下聚ATP核糖基化反应启动会消耗大量ATP,导致能量代谢障碍并触发细胞凋亡[11],而线粒体介导的细胞凋亡是Cr(Ⅵ)诱导肿瘤发生发展的一个重要机制[12]。该蛋白在经Cr(Ⅵ)染毒的PARG缺陷细胞的表达量高于正常16HBE细胞,推测Cr(Ⅵ)通过干扰或抑制细胞内ATP合成或合成的某些环节来影响细胞的正常功能,而PARG的缺陷降低了这种抑制作用。TCPB是CCT蛋白复合物的β亚基,作为分子伴侣,CCT利用水解ATP产生的能量协助蛋白质折叠。Yokota等[13]发现CCT在肿瘤细胞高表达,前期研究也发现该蛋白在细胞周期的S前期高表达,且其水平与细胞的生长速率相关,而快速增殖是肿瘤细胞的标志之一,推测PARG缺陷细胞通过下调该蛋白来对抗Cr(Ⅵ)的致癌作用。
分析质谱鉴定的cofilin1的氨基酸序列,发现碱性氨基酸(H/K/R)在蛋白中连续2个或多个出现,疏水性氨基酸(M/W/F/V/L/I/P/A)紧连着碱性氨基酸出现,这与其他学者报道[14]的PAR结合保守序列的规律相似,由此推测该蛋白可与PAR相互结合。选取该差异蛋白进行Western blot,进一步验证了蛋白质组学的结果。cofilin1是一种肌动蛋白结合蛋白,影响诸如细胞迁移、增殖和凋亡等重要的生理功能。越来越多的研究表明,cofilin1与肿瘤的迁移、侵袭有关,抑制cofilin1活性可以减少肿瘤细胞的运动和入侵[15]。cofilin1的过表达还降低了细胞的DNA修复能力[16],而PARP和PARG共同参与的聚ADP核糖基化反应是DNA损伤修复重要步骤[17]。本实验中,16HBE细胞染毒后cofilin1表达上调,而PARG缺陷细胞染毒后该蛋白表达无明显变化,推测PARG的缺陷通过某些环节抑制了cofilin1的表达,从而减少细胞的迁移,增强DNA修复的能力,抑制Cr(Ⅵ)诱导的肿瘤发生。
综上,本研究中所鉴定的差异蛋白大多与肿瘤发生密切相关,推测Cr(Ⅵ)作用后,聚ADP核糖基化反应可通过抑制Cr(Ⅵ)诱导的肿瘤发生,从而对抗Cr(Ⅵ)的细胞毒性,这为阐明聚ADP核糖基化在Cr(Ⅵ)致细胞损害中的作用机制提供了重要的参考依据。

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