中华预防医学杂志    2014年09期 杭州市2004–2011年戊型肝炎流行特征及病原学分析    PDF     文章点击量:4119    
中华预防医学杂志2014年09期
中华医学会主办。
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考庆君 孙昼 谢立 濮小英 杨旭辉 黄仁杰
KaoQingjun,SunZhou,XieLi,PuXiaoying,YangXuhui,HuangRenjie
杭州市2004–2011年戊型肝炎流行特征及病原学分析
Analysis of epidemiologic and etiology of hepatitis E in Hangzhou, 2004-2011
中华预防医学杂志, 2014,48(9)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.09.005
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投稿日期: 2013-10-18
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杭州市2004–2011年戊型肝炎流行特征及病原学分析
考庆君 孙昼 谢立 濮小英 杨旭辉 黄仁杰     
考庆君 310021 杭州市疾病预防控制中心传染病防制所
孙昼 310021 杭州市疾病预防控制中心传染病防制所
谢立 310021 杭州市疾病预防控制中心传染病防制所
濮小英 310021 杭州市疾病预防控制中心传染病防制所
杨旭辉 310021 杭州市疾病预防控制中心传染病防制所
黄仁杰 310021 杭州市疾病预防控制中心传染病防制所
摘要: 目的  分析杭州市2004–2011年戊型肝炎(简称戊肝)的流行特点以及戊肝病毒基因分型特点。方法  利用中国疾病预防控制信息系统《疾病监测信息报告管理系统》,收集2004–2011年杭州市戊肝的发病情况及患者的基本信息。于2011年在杭州市定点传染病医院,采用随机数字表法选取实验室已确诊的戊肝患者65例,采集其血液标本60份及粪便标本18份;在全市范围内采用随机整群抽样的方法选取杭州市1个城区及2个周边县区,选取该区生猪定点屠宰场及农户作为采样点,采集猪胆囊标本52份,采集散养猪和兔子的粪便分别为30和15份。对标本进行戊肝病毒检测,并进行基因提取和基因序列分析,将测得的核酸序列与GenBank数据库中戊肝病毒毒株的基因序列进行比对,并绘制进化树。对2004–2011年杭州市戊肝发病流行特征进行描述,分析杭州市各年份及性别间戊肝发病率的差异。结果  2004–2011年杭州市累计报告戊肝患者3 490例,死亡3例,年平均发病率为5.79/10万(3 490/60 276 338)。不同年份间发病率呈上升趋势(χ2=52.38,P<0.01),其中2011年最高,为8.10/10万(705/8 700 373),2005年最低,为4.19/10万(304/7 259 008);男性[8.12/10万(2 474/30 450 990)]高于女性[3.46/10万(1 016/29 384 491)] (χ2=558.45,P<0.05)。采集确诊患者血液及粪便标本共78份,检出阳性标本16份,阳性率为21%,采集猪胆、猪粪便、兔子粪便标本共97份,检出2份兔子粪便阳性标本,阳性率为2%。杭州市分离的戊肝病毒基因以Ⅳ型为主,同源性为91.8%~100%;与人戊肝病毒Ⅳ型毒株同源性为84.6%~96.7%;与猪分离的戊肝Ⅳ型病毒株同源性为82.6%~95.2%。结论  杭州市戊肝发病年呈逐年上升趋势,戊肝病毒基因型以Ⅳ型病毒株为主,在人群中与猪群中存在高度同源性。
关键词 :肝炎,戊型;肝炎病毒,戊型;基因型;流行特征;疾病控制
Analysis of epidemiologic and etiology of hepatitis E in Hangzhou, 2004-2011
KaoQingjun,SunZhou,XieLi,PuXiaoying,YangXuhui,HuangRenjie     
Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Hangzhou Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310021, China
Corresponding author: Sun Zhou, Email: hzcdc@qq.com
Abstract:Objective  To comprehend the epidemiologic of hepatitis E and genetic characteristics of hepatitis E virus (HEV) in Hangzhou from 2004 to 2011.Methods  Using China information system for disease control and prevention, the incidence of hepatitis E from 2004 to 2011 in Hangzhou city, and the basic information of patients were collected. In 2011, 65 hepatitis E laboratory confirmed cases were selected by random number table sampling method from the hospitals designated infectious diseases in Hangzhou city, and acquisition of the 60 blood specimens and stool specimens of 18 copies. One city and two surrounding counties were selected by cluster random sampling method in the context of Hangzhou city, and the pig slaughters and farmers were selected as the sampling point, and acquisition of pig gallbladder specimens of 52 copies, and 30 stool samples of scatter-feed pigs, 15 stool specimens of scatter-feed rabbits. HEV was tested in samples, gene extraction and analysis of gene sequence were conducted which were compared with gene bank HEV gene sequence, and a phylogenetic tree was formed. The epidemic characteristics of hepatitis E of Hangzhou city from 2004 to 2011 were described. The difference of incidence of hepatitis E was analyzed between years and sexes in Hangzhou city.Results  There were reported a total of 3 490 cases of hepatitis E in Hangzhou from 2004 to 2011, and 3 cases of death; The average annual incidence rate was 5.79/100 000 (3 490/60 276 338). There was the overall upward trend in incidence between different years (χ2=52.38, P<0.01), which the highest was 8.10/100 000 (705/8 700 373) in 2011, and the lowest incidence rate was 4.19/100 000 in 2005. The incidence of males (8.12/100 000 (2 474/30 450 990)) was significantly higher than that of the females (3.46/100 000 (1 016/29 384 491)) (χ2=558.45, P<0.05). 78 specimens of blood and stool were collected, including 16 positive samples, with positive rate 21%. There were a total of 97 specimens of pig gallbladder, pig manure and rabbit stool, including 2 positive rabbit stool samples, with positive rate of 2%. HEV genes isolated from Hangzhou were mainly type Ⅳ, with homology of 91.8% to 100%; compared with human type Ⅳ strains, the homology of nucleotide was 84.6%-96.7%; compared with type Ⅳ strain of pig genome sequence alignment, homology was 82.6%-95.2%.Conclusion  Hepatitis E′s incidence showed an increasing trend year by year in Hangzhou. HEV of type Ⅳ was dominant, and HEV strains in the human and swine were highly homologous.
Key words :Hepatitis E;Hepatitis E virus;Genotype;Epidemiologic characteristics;Disease control
全文

戊型肝炎(简称戊肝)是一种由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)引起的经粪–口途径传播的急性消化道传染病。主要流行于亚洲、非洲和中美洲的一些发展中国家,既可呈散发,也可引起暴发流行[1]。随着人们对戊肝认识的不断提高,其危害也逐渐得到人们重视,目前戊肝已被WHO认为是发展中国家重要的公共卫生问题之一[2]。我国是戊肝高发地区之一,1986–1988年新疆维吾尔自治区发生迄今为止世界上规模最大的戊肝流行,共计发病119 280例,死亡707例,造成了极大的危害[3]。笔者对杭州市2004–2011年戊肝流行特征、HEV基因型别以及变异状况进行分析,以便掌握杭州市戊肝发病趋势和流行特征和基因变异情况,有针对性开展防治工作。

资料与方法  

1.数据来源:  利用中国疾病预防控制信息系统《疾病监测信息报告管理系统》,收集2004–2011年杭州市戊肝的发病情况及患者的基本信息,包括性别、年龄、居住地等。患者诊断参照戊肝诊断标准WS 301–2008[1]。2004–2011年杭州市人口资料来源于杭州市统计局。

2.样品采集:  于2011年选取杭州市定点传染病医院,采用随机数字表法选取实验室确诊的戊肝患者(抗HEV IgM阳性)65例,采集其血液标本60份及粪便标本18份,所有标本均由Hanks液制备成悬浮液,冻存–80 ℃备用;在全市范围内采用整群随机抽样的方法选取杭州市1个城区及2个周边县区,选取该区生猪定点屠宰场采集猪胆囊标本52份,采用随机数字表选取部分农户,采集散养猪粪便30份及散养兔子粪便标本15份。

3.主要试剂和器材:  实时荧光RT–PCR、一步法普通PCR试剂购自宝生物工程(大连)有限公司;QIAamp Viral RAN Kit提取试剂盒购自德国Qiagen公司;基因测序所需感受态细胞制备试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司;pGEMT和pGEMT–Easy载体系统购自美国Promega公司;质粒DNA小量提取试剂(离心柱型)和胶回收试剂盒购自美国Axygen公司。实时荧光RT–PCR及基因序列测定所需的引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。荧光PCR仪购自德国Qiagen公司,梯度PCR仪购自德国Biometra公司,电泳仪购自美国伯乐公司。

4.HEV的RNA检测与基因序列分析:  (1)病毒核酸的提取:对采集的标本提取总病毒RNA,用QIAamp Viral RAN Kit提取试剂盒,按说明书进行操作。(2)HEV的RNA检测:HEV基因变异较大,有3个部分重叠的开放读码区(ORF),基于对GenBank中HEV的ORF区域基因组序列的多序列比对,选择其中较为保守的ORF3区域作为扩增位点。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。引物序列为,引物1:5′–GGTGGTTTCTGGGGTGAC–3′;引物2:5′–AGGGGTTGGTTGGATGAA–3′;引物3:5′–TGATTCTCAGCCCTTCGC–3′。采用TaqMan探针的方法进行实时荧光RT–PCR[4],通过检测反应体系中的荧光强度,检测PCR产物的扩增量。(3)基因测序:对实时荧光RT–PCR法检测结果为阳性且浓度较高(Ct值<30)的标本进行普通PCR扩增,然后将PCR产物直接进行基因序列测定。PCR程序设置按照参考文献[5]提供的方法操作,采用2组套式引物进行PCR,所需的引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。引物1为通用引物,引物2为针对Ⅳ型基因型,具体见表1

表1PCR测序所用引物序列

5.系统进化分析:  将测得的核酸序列用DNAMAN软件进行多序列比对排列并绘制进化树。从美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的GenBank数据库中下载17条HEV全长序列作为比对的参考的HEV毒株的基因序列。具体见表2。应用Mega 5.03软件对参考序列病毒株和本研究中获得病毒株的核苷酸序列进行比对,并形成进化树,采用DNAStar软件绘制同源性图。

表2参考的全序列戊型肝炎病毒株

6.统计学分析:  采用Excel 2003对数据进行录入,采用SPSS 16.0软件进行资料整理和统计分析。结合杭州市人口资料,计算2004–2011年杭州市戊肝发病率;采用描述性流行病学方法,对2004–2011年杭州市戊肝发病流行特征进行描述。采用χ2检验分析杭州市各年份及性别间戊肝发病率的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.流行特征:  (1)发病情况:2004–2011年杭州市累计报告戊肝患者3 490例,死亡3例,年平均发病率为5.79/10万(3 490/60 276 338)。不同年份间发病率呈上升趋势(χ2=52.38,P<0.01),其中2011年最高,为8.10/10万(705/8 700 373),2005年最低,为4.19/10万(304/7 259 008);男性[8.12/10万(2 474/30 450 990)]高于女性[3.46/10万(1 016/29 384 491)](χ2=558.45,P<0.05),具体见表3。(2)分布特征:2004–2011年全年均有患者,其中1–3月份发病数所占比例最高,为35.79%(1 249/3 490),7–9月份最低,为18.31%(639/3 490),4–6月份和10–12月份分别为25.27%(882/3 490)和20.63%(720/3 490);发病集中在25~65岁之间,占发病总数的84.58%(2 787/3 490),<25岁占6.73%(235/3 490),>65岁的占8.68%(303/3 490)。职业分布以农民为主,占36.07%(1 259/3 490),依次为工人[15.56%(543/3 490)]及离退休人员[10.52%(367/3 490)]。

表32004–2011年杭州市不同性别居民戊型肝炎的发病情况

2.HEV RNA的检测情况:  (1)样本:2011–2012年,采集确诊患者血液及粪便标本共78份(血液60份,粪便18份),其中16份为阳性,阳性率为21%(16/78);血液标本中6份阳性,阳性率为10%(6/60),粪便标本中10份阳性,阳性率为10/18。(2)动物标本:采集猪胆、猪粪便、兔子粪便标本共97份,其中2份为阳性,均为兔子粪便标本,阳性率为2%(2/97)。

3.基因分型检测:  挑选实时荧光RT–PCR法阳性且浓度较高的3份标本(编号为hangzhou6、8、19)进行RT–PCR,扩增其特异的基因片段,之后用2套套式PCR引物扩增出目的片段并进行基因测序,测序结果显示,Hangzhou6和Hangzhou8的同源性达100%,Hangzhou19与两者的同源性仅为91.8%。

4.同源性比对分析:  (1)基因分型及同源性分析:对完成测序的3株病毒株基因核苷酸序列与GenBank中全基因序列的HEV毒株进行BLAST比较,与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型参考毒株进行比对,核苷酸序列同源性分别为75.3%~76.3%、74.1%~74.2%、78.0%~78.4%、84.6%~96.7%,显示3株毒株均为HEV Ⅳ型。3株毒株与人Ⅳ型毒株序列(chi–T1–AJ272108–chi–2000、Changchun–AB108537–chi–2000、Shanghai–AB197674–chi–2001、Xi′an–AB197673–chi–1998,核苷酸同源性为84.4%~93.7%)进行比对,核苷酸同源性分别为84.6%~85.9%、84.6%~84.7%、93.0%~93.2%、92.2%~96.7%;与猪基因Ⅳ型病毒株序列(Sw01–AY723745–ind–2006、Swine–GU119960–chi–xinjiang–2009、Swine–FJ610232–chi–gansu–2008、Swine–ef570133–chi–shanghai– 2005、Swine–DQ450072–chi–shanghai–2005,核苷酸同源性为83.1%~96.5%)比对,核苷酸同源性分别为85.4%~86.3%、91.8%~95.2%、84.2%~84.8%、83.0%~83.9%、82.6%~84.1%。(2)进化树构建:将3株病毒株基因序列与HEV各基因型参考的全序列HEV病毒株进行同源性分析,绘制进化树(图1)。结果显示,本次研究分离的3株HEV病毒株在HEV Ⅳ型分支上,与西安株、新疆株、上海株在同一簇上,同源性为91.8%~96.7%。与北京、长春、上海、西安等地的分离人Ⅳ型毒株(AJ272108、AB108537、AB197674、AB197673)的同源性为84.6%~96.7%。与猪分离的HEV Ⅳ型基因序列比较,发现与新疆分离的毒株(GU119960)同源性最高,为91.8%~95.2%。与其他地区(上海、甘肃等)猪分离的毒株(FJ610232、ef570133、DQ450072)同源性较低,仅82.6%~84.8%。

图1杭州市戊型肝炎病毒毒株核苷酸序列系统进化树

讨论  在我国,戊肝的发病率和感染率均较高,多为散发性流行[6]。笔者分析了2004–2011年杭州市戊肝的流行特征,结果显示,杭州市戊肝发病以散发为主,发病率呈逐年上升趋势。发病集中在25~65岁,男性发病率高于女性,推测与该人群成年走向社会,生活和行为方式发生了改变,且男性外出活动较多有关。职业分布以农民为主。因为农业人口基数大,易接触猪,而且猪是HEV最主要的动物宿主,故容易发病[7,8,9,10]
        本研究通过RT–PCR方法对78份戊肝患者血液及粪便标本进行了HEV检测,阳性率为20.51%。有研究显示,戊肝在疾病的早期RNA阳性率较高,随着时间的延长逐渐下降,发病后第4周抗HEV IgM阳性率达93.8%,而HEV RNA阳性率仅有9.4%[11]。本研究患者标本来自抗HEV IgM阳性患者,因此HEV RNA检出率相对较低。戊肝已被认为是一种人畜共患病,猪是HEV最主要的动物宿主,我国猪群中HEV RNA的检出率为1.8%~24%[12,13,14]。陆一涵等[15]调查显示,浙江省猪的HEV检出率较低,仅为2.5%,低于江苏省(6%)和安徽省(5%)。本研究从猪胆囊及猪粪便标本中均未检出戊肝病毒,可能与本地猪感染率较低有关。本研究从兔子粪便中检出的2份HEV核酸阳性标本,但由于病毒浓度偏低,未做基因序列分析。有研究已从家兔中获得新的基因型–兔HEV[14,16],但该基因组是否会传染给人,仍有待进一步探讨。
        HEV病毒株主要划分为四个基因型(Ⅰ~Ⅳ型),中国HEV病毒株主要为Ⅰ型和Ⅳ型[10,12]。本研究对分离的病毒株序列进行核苷酸同源性分析,结果均为Ⅳ型,且同源性较高,表明杭州市HEV以Ⅳ型病毒株为主。此外,通过与北京(AJ272108)、长春(AB108537)、上海(AB197674)、西安(AB197673)等地的人Ⅳ型毒株同源性进行比较,同源性为84.6%~96.7%,与我国多地的研究结果一致[7,8,17,18]。任宏等[7]研究显示,上海市人群和猪群间HEV核苷酸同源性为83.09%~97.96%,存在高度同源性。本研究将杭州HEV基因序列与GenBank基因库中猪分离的HEV Ⅳ型代表基因序列(GU119960、FJ610232、ef570133、DQ450072)进行比对,同源性为82.6%~95.2%。提示杭州市HEV在人群中与猪群中存在高度同源性。

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