中华预防医学杂志    2014年09期 邻苯二甲酸酯暴露对产妇11β-羟基类固醇脱氢酶活性的影响    PDF     文章点击量:3314    
中华预防医学杂志2014年09期
中华医学会主办。
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胡小娅 赵岩 陈北涛梁园 李露茜 谢长明 张蕴晖 林振浪 谢爱兰 陈尚勤
邻苯二甲酸酯暴露对产妇11β-羟基类固醇脱氢酶活性的影响
中华预防医学杂志, 2014,48(9)
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邻苯二甲酸酯暴露对产妇11β-羟基类固醇脱氢酶活性的影响
胡小娅 赵岩 陈北涛梁园 李露茜 谢长明 张蕴晖 林振浪 谢爱兰 陈尚勤     
摘要: 目的研究产妇尿液中邻苯二甲酸酯类(PAEs)物质代谢物的水平与11β-羟基类固醇脱氢酶(11β-HSD2酶)活性的关联,初步探索PAEs影响胎儿宫内发育的可能机制。方法2012年采用单纯随机抽样法抽取宫内发育迟缓(IUGR)新生儿33例,并匹配正常对照新生儿33名,采用高效液相色谱-串联质谱法测定产妇尿液中4PAEs代谢物,即邻苯二甲酸单丁酯(MBP)、邻苯二甲酸(2-乙基己基)单酯(MEHP)、邻苯二甲酸(2-乙基-5羟基己基)单酯(MEHHP)、邻苯二甲酸(2-乙基-5氧己基)单酯(MEOHP)和3种皮质醇皮质酮代谢物,即四氢皮质醇(THF)、allo-四氢皮质醇(allo-THF)、四氢皮质酮(THE)的含量,并分析产妇尿液中PAEs代谢物的水平与11β-HSD2酶活性的关联。结果66名产妇尿液样本中MBPMEHPMEHHPMEOHP代谢物的检出率分别为98%65名)、89%59名)、91%60名)、91%60名);病例组母亲尿液样本中MBPMEHHPMEOHPDEHP合计(SumDEHP)的中位数分别为31.2024.6111.7248.67 ng/ml,高于对照组(分别为17.3212.035.6828.64 ng/ml),差异均具有统计学意义(P值均<0.05);病例组母亲体内11β-HSD2的活性[(THF+allo-THF)/THE=0.79±0.09 ng/ml]低于对照组[(THF+allo-THF)/THE=0.58±0.04 ng/ml];男婴母亲尿液中MBP(β′=1.12)MEHHP(β′=1.14)MEOHP(β′=1.10)SumDEHP(β′=1.08)的含量与11β-HSD2的活性呈负相关,差异有统计学意义(P值均<0.05)。 结论PAEs可能通过抑制11β-HSD2的活性影响胎儿宫内发育。
关键词 :胎儿生长迟缓;四氢皮质醇;邻苯二甲酸酯;宫内发育迟缓;11β羟基类固醇脱氢酶
    
Abstract:

ObjectiveTo study the association between phthalate esters (PAEs)  metabolites in maternal urine and 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 211β-HSD2 enzyme activity,  explore the possible mechanism of PAEs effect on fetal development. MethodsAll of 33 cases of intrauterine growth retardation (IUGR) newborn were selected by random sampling in 2012. And 33 cases of normal control newborn were enrolled, use high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was used to detect 4 kinds of phthalate esters (PAEs)  metabolites  in maternal urinemono-n-butyl phthalate ester (MBP), mono (2-ethylhexyl) phthalate (MEHP), mono (2-ethyl-5-hydroxyhexyl) phthalate(MEHHP), mono (2-ethyl-5-oxohexyl) phthalate (MEOHP) and three kinds of cortisol corticosterone metabolites,tetrahydrocortisol (THF), allo-tetrahydrocortisol (allo-THF), tetrahydrocortisone (THE), and analyze the association between phthalate esters (PAEs)  metabolites in maternal urine and 11β-HSD2 enzyme activity. ResultsMBPMEHPMEHHPMEOHP metabolites can be detected in 98%65 cases,89%59 cases,91%60 cases,91%60 casesof all 66 maternal urine samples, respectively. The median concentrations of test material in case group were 31.20 ng/ml for MBP24.61 ng/ml for MEHHP11.72 ng/ml for MEOHP and 48.67 ng/ml for SumDEHP which were significantly higher than those of the control groupwere 17.32,12.03,5.68 and 28.64 ng/ml; 11β-HSD2 activity in case group(THF+allo-THF)/THE=(0.79±0.09) ng/mlwas significantly lower than that of the control group((THF+allo-THF)/THE=(0.58±0.04) ng/ml);  PAEs metabolites MBP(β′=1.12),MEHHP(β′=1.14),MEOHP(β′=1.10),SumDEHP(β′=1.08) in baby boy mothers urine was reversely correlated to 11β-HSD2 activity. ConclusionsPAEs could affect fetal development by inhibit 11β-HSD2 activity.

Key words :Fetal growth retardation;Tetrahydrocortisol;Phthalate esters;Intrauterine retarded;11βhydroxy steroid dehydrogenase
全文

邻苯二甲酸酯类物质(PAEs)作为增塑剂广泛应用于聚氯乙烯(PVC)制品、儿童玩具、化妆品、建筑材料、汽车配件、医疗器材等塑料产品中。目前应用最广泛的是邻苯二甲酸(2乙基己基)酯(DEHP)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)。释放到环境中的PAEs通过消化道、呼吸道和皮肤等途径进入人体[12]。动物毒理学的研究结果表明,PAEs具有雄性生殖发育毒性、免疫毒性、肝脏毒性和致癌作用[36]。人群流行病学的研究结果表明,环境水平的DEHP暴露与胎儿宫内发育不良间存在关联[7]。然而,宫内PAEs暴露影响胎儿发育的机制仍不明确。
研究表明,糖皮质激素的过度暴露与胎儿宫内发育迟缓(IUGR)的发生密切相关[89]。11β羟基类固醇脱氢酶(11βHSD)是糖皮质激素代谢的关键酶。该酶有两种同工酶,Ⅰ型(11βHSD1)主要表达于肝脏和脂肪组织,催化无生物活性的糖皮质激素(皮质酮)向有生物活性的糖皮质激素(皮质醇)的转化;Ⅱ型酶(11βHSD2)主要表达于盐皮质激素的靶组织,催化皮质醇向皮质酮的转化,防止皮质醇与盐皮质激素受体(MR)的结合。在怀孕期间,母体胎盘组织也分泌大量的11βHSD2。胎盘中的11βHSD2将皮质醇转化为皮质酮,避免胎儿暴露于母体高水平的皮质醇[1011]。体外细胞实验和动物实验的研究结果表明[1214],PAEs能抑制11βHSD2的表达,这提示我们PAEs可能通过抑制胎盘11βHSD2的活性,导致胎儿暴露于过多的皮质醇,影响胎儿宫内发育。
    在本研究中,笔者通过测定产妇尿液中几种代表性的PAEs代谢物,包括邻苯二甲酸单丁酯(MBP)、邻苯二甲酸(2乙基己基)单酯(MEHP)、邻苯二甲酸(2乙基5羟基己基)单酯(MEHHP)和邻苯二甲酸(2乙基5氧己基)单酯(MEOHP)的水平评估产妇PAEs的一般暴露状况;通过测定产妇尿液中四氢皮质醇(THF)、allo四氢皮质醇(alloTHF)和四氢皮质酮(THE)评估产妇体内11βHSD2 的活性;通过分析PAEs的暴露水平与11βHSD2活性间的关联,探索PAEs影响胎儿宫内发育的可能机制。
材料与方法
1研究对象:收集2012年6—12月采用单纯随机抽样法在温州医科大学附属第二医院出生的,体重在同胎龄儿出生体重第10百分位数以下或低于平均体重的2个标准差的新生儿[15]及其母亲作为病例。本研究通过了温州医科大学附属第二医院伦理审查委员会的审查。对照选取于同一医院,分娩日期相差不超过一周的正常新生儿,即37周≤胎龄<42周,出生体重处于2 500~4 000 g 范围内无畸形或疾病的婴儿。共收集IUGR新生儿33例,正常对照新生儿33名。每位纳入研究的新生儿母亲均签署知情同意书。分娩后2 d内填写一份有关孕期基本状况、社会经济因素的问卷。根据医院的记录获得新生儿的基本人口学信息。
    2尿液PAEs代谢物的测定: (1)样品采集和预处理:收集产妇分娩后一天内的尿液,置于-80 ℃保存待用。取05 ml尿样置于4 ml玻璃瓶中,然后依次加入200 μl乙酸铵溶液(77 g乙酸铵溶解于100 ml高纯水和6 ml乙酸中,调节pH至450)、50 μl β葡萄糖苷酸酶(2 μl/ml)、100 μl 4甲基伞形花酮葡萄糖苷酸溶液(500 ng/ml)、50 μl 13C4MEOHP(250 ng/ml,作为回收率指示物)和 500 μl高纯水。拧紧瓶盖,置于水浴锅中进行水浴加热,温度设定为37 ℃,放置过夜,使尿液样品和酶促反应充分。在酶促反应完全的尿液样品中加入 1 ml的磷酸缓冲液(20 g一水磷酸二氢钠溶解于1 000 ml高纯水和10 ml磷酸的混合溶液,调pH至20)用以稀释尿液样品。通过预先处理(15 ml乙腈和12 ml磷酸缓冲液活化)的SPE固相萃取小柱(ABS ELUTNEXUS,美国Varian公司)。然后分别用1 ml甲酸(01 mol/L)溶液和 12 ml高纯水淋洗固相萃取小柱。并在空气中自然风干 5 min。最后再用 12 ml乙腈和 11 ml乙酸乙酯淋洗固相萃取小柱,并收集这部分洗脱液。洗脱液在氮气流中进行浓缩,吹干,并以500 μl乙腈∶水的体积比1∶9定容。(2)样品的仪器分析:本研究所用的仪器为高
表1产妇尿液几种PAEs代谢物的检出率及含量
PAEs
代谢物检出率[%(名)]病例组
(33例)对照组
(33名)合计(66名)中位数(ng/ml)病例组对照组合计几何均数(ng/ml)病例组对照组合计统计值P值MBP100(33)97(32)98(65)312017322274313412671993347a﹤001MEHP100(33)79(26)89(59)626628627649409515-136a0179MEHHP100(33)81(27)91(60)24611203169724137681361-358b﹤001MEOHP100(33)82(27)91(60)11725688881162413693-328b﹤001SumDEHP---486728643950453517572823316a﹤001注:PAEs:邻苯二甲酸酯;MBP: 邻苯二甲酸单丁酯;MEHP: 邻苯二甲酸(2乙基己基)单酯;MEHHP: 邻苯二甲酸(2乙基5羟基己基)单酯;MEOHP: 邻苯二甲酸(2乙基5氧己基)单酯;DEHP合计(SumDEHP)= MEHP + MEHHP + MEOHP;aMBP、MEHP和SumDEHP的浓度经对数转换后使用参数t检验,bMEHHP和MEOHP使用MannWhitney U检验效液相色谱串联质谱仪。高效液相色谱仪(Agilent 1200 Series HPLC system,美国Agilent公司),质谱仪检测器(美国AB Sciex Instruments公司)。液相色谱条件:色谱柱:Venusil XBP Phenyl(21 mm×100 mm,5 μm);流动相:体积分数为01%的乙酸∶水溶液(流动相 A),体积分数为01%乙酸∶乙腈水溶液(流动相B)。质谱条件:离子源为负离子源,碎片电压为-4 500 V,接口温度为500 ℃,离子检测模式为多重反应检测模式(multiple reaction monitoring,MRM)。载气和反应气均为N2。
3产妇尿液中THE、THF和alloTHF的检测:(1)样品前处理:取尿样200 μl,加入400 μl醋酸铵缓冲液(038 g醋酸铵溶解并稀释于10 ml高纯水,冰醋酸调节pH至510 )和4 μl地塞米松内标溶液(5 μg/ml),混匀后再加入5 μl葡萄糖醛酸脱氢酶(helix pomatia),置于55 ℃摇床内孵育2 h,使尿样中THE、THF和alloTHF游离。取出冷却后上固相萃取小柱,用1 ml去离子水洗涤后,100 μl乙腈洗脱收集。(2)检测仪器:本研究中所使用的仪器为高效液相色谱串联质谱仪。高效液相色谱仪(Agilent 1200 Series HPLC system,美国Agilent公司);三重四极杆串联质谱仪(API4000 QTRAP MS/MS)。 色谱条件:色谱柱:Inertsil ODS3(21 mm×150 mm ID,3 μm);流动相:体积分数为01%甲酸∶水溶液(流动相A),体积分数为01%乙腈∶水溶液(流动相B)。质谱条件:液相色谱质谱联用接口:电喷雾接口(ESI)正离子模式;气帘气压力:20 psi;离子源温度:500 ℃;电喷雾电压:4 500 V。
4统计学分析: 采用Epidata 31录入数据,并采用 SPSS 170进行统计分析。样品浓度均为仪器检测值扣除空白样品值,样品浓度低于检测限(LOD)以 1/2 LOD计算。4种目标物质 MBP、MEHP、MEHHP 和MEOHP 的LOD均为 050 μg/L。计算DEHP合计值(SumDEHP)= MEHP + MEHHP + MEOHP。通过尿比重矫正4种目标物的浓度,矫正公式为:Pc=P×[(1024-1)/(SG-1)] 。其中Pc为尿比重矫正后的浓度,P为仪器检测浓度,SG为尿比重。将各代谢物MBP、MEHP、MEHHP和MEOHP的浓度进行对数转换后,用中位数、几何均数表示,其中MBP、MEHP及SumDEHP属于偏态分布,经对数转换后为正态分布,使用参数t检验,MEHHP和MEOHP属于偏态分布,使用MannWhitney U检验;建立多元线性回归模型,矫正孕周、孕前BMI、吸烟和饮酒等混杂因素后分析PAEs的暴露水平与11βHSD2活性的关联,以P<005为差异有统计学意义。
结果
1一般人口学状况:66对新生儿及其母亲被纳入本次研究,其中IUGR新生儿33例,出生体重为(243±032)kg,出生体长为(4777±189)cm,孕周为(3840 ± 187)周;正常对照新生儿为33例,出生体重为(322±032)kg, 出生体长为(5045±096)cm,孕周为 (3933±098) 周。病例组与对照组在新生儿性别、产妇孕前BMI、吸烟及饮酒等方面差异无统计学意义,但病例组新生儿的出生体重、出生体长及孕周低于对照组新生儿。           
   2产妇PAEs的一般暴露状况:收集产妇产后1 d的尿样,测定了1种DBP的代谢产物(MBP)、1种DEHP的一级代谢产物(MEHP)及2种DEHP的二级代谢产物(MEHHP和MEOHP)的浓度。病例组与对照组产妇尿中各测定物的检出率、中位数及几何均数见表1。由表1可以看出,超过90%的样本均能检测到4种目标物。除MEHP外,病例组产妇尿液中MBP、MEHHP、MEOHP及DEHP合计的含量均高于正常对照组(P<001)。
表3不同性别婴儿母亲的尿液中PAEs的含量与(THF+alloTHF)/THE比值的关联
代谢物男婴母亲(32名)β值s值β′值t值P值女婴母亲(34名)β值s值β′值t值P值MBP053006112357<0010150280100870392MEHP0190120371010307-024014-026-1460143MEHHP054005114357<0010170230140540669MEOHP053005110358<001-012019-013-0770451SumDEHP050007108309<001-016016-016-0940340注:PAEs:邻苯二甲酸酯;MBP: 邻苯二甲酸单丁酯;MEHP: 邻苯二甲酸(2乙基己基)单酯;MEHHP: 邻苯二甲酸(2乙基5羟基己基)单酯;MEOHP: 邻苯二甲酸(2乙基5氧己基)单酯;THF:四氢皮质醇;THE:四氢皮质酮;alloTHF:allo四氢皮质醇;DEHP合计(SumDEHP)= MEHP + MEHHP + MEOHP3.产妇尿液中THF与THE的含量:在5α、5β还原酶及3α羟基类固醇脱氢酶(3αHSD)的作用下,皮质醇代谢为THF和alloTHF,而皮质酮则代谢为THE,因而可通过测定尿液中(THF+alloTHF)与THE的比值来评估母体11βHSD2活性[10]。由表2可以看出,虽然病例组母亲尿中THE、(THF+alloTHF)的含量与对照间差异无统计学意义,但病例组(THF+alloTHF)/THE的比值高于对照组(P=0038),这表明病例组产妇体内11β HSD2的活性低于对照组。

表2产妇尿液中THF、THE的含量及(THF+
alloTHF)/THE的比值
检测指标病例组(33例)对照组(33名)t值P值THF+alloTHF
(ng/ml)3 37556±716682 37584±210801340186THE(ng/ml)4 51707±783704 48451±426180040971(THF+allo
THF)/THE079±009058±0042120038注:THF:四氢皮质醇;THE:四氢皮质酮;alloTHF:allo四氢皮质醇

4产妇尿液中PAEs代谢物的含量与11β HSD2活性的关联:以(THF+alloTHF)/THE的比值为Y变量,以对数转化的四种目标物的浓度为X变量,建立多元线性回归模型, 并将孕周、孕前BMI、吸烟和饮酒等可能的混杂因素纳入回归模型。表3结果显示,尿液中MBP的浓度与(THF+alloTHF)/THE的比值正相关,即产妇尿液中MBP的浓度越高,11βHSD2活性越低。分性别研究目标物的浓度与酶活性间的关联,结果显示,男婴母亲尿液中MBP、MEHHP、MEOHP及SumMEHP的浓度与 (THF+alloTHF)/THE的比值呈正相关,女婴母亲尿液中目标物的浓度均与(THF+alloTHF)/THE的比值不相关。
讨论
PAEs是人类最常接触的增塑剂类物质。2010年,我国PAEs的生产量约为198万吨,占增塑剂总生产量的85%~90%,DBP和DEHP是其中生产量和使用量较大的两种增塑剂[16]。本次研究中测定的MBP是DBP的活性代谢产物,MEHP是DEHP的一级代谢产物,MEHHP和MEOHP是DEHP的二级代谢产物[17]。
这些物质通过消化道、呼吸道、皮肤等途径进入人体后迅速代谢。有研究显示,尿液中PAEs代谢物的水平可以预测近3个月人体PAEs的暴露水平[18]。在我们的研究中,问卷调查结果显示,产妇在整个孕期PAEs的暴露途径比较固定,其生活习惯也没有发生改变,因而我们获得的PAEs暴露资料可以在一定程度上反映产妇孕中期及晚期PAEs的暴露状况。笔者还发现,将近90%的产妇尿液中均能检出4种目标物质,这表明产妇孕期普遍暴露于PAEs环境中。另外,我们还发现病例组产妇尿液中MBP、MEHHP、MEOHP和SumDEHP的含量高于正常对照组(P<005),这表明病例组新生儿DBP和DEHP的宫内暴露量明显高于对照组新生儿,其暴露量可能与新生儿IUGR的形成有一定的关联。
尽管动物实验的证据表明,PAEs能够影响胎鼠发育[19],但其对人类新生儿的胚胎毒性及其作用机制尚不明确。研究表明,11βHSD2是糖皮质激素代谢的关键酶,催化皮质醇向皮质酮的转变,保护胎儿免受母体高水平的皮质醇的损害[1011]。我们的研究发现,病例组产妇体内11βHSD2的活性低于对照组。在怀孕期间,母体胎盘组织分泌大量的11βHSD2,是体内11βHSD2的主要来源。因此,我们推测病例组产妇胎盘组织中11βHSD2的活性低于对照组。由于胎盘11βHSD2的活性较低,母体过多的皮质醇进入胎儿体内,影响胎儿宫内发育,导致IUGR的发生。
动物实验和体外细胞实验的结果证明了PAEs能够影响11βHSD2的表达[1214],本研究使用多元线性回归矫正可能的混杂因素后发现产妇尿液中PAEs的水平与11βHSD2的活性呈负相关,这提示我们PAEs可能通过抑制11βHSD2的活性影响胎儿宫内发育,此外这种影响在男婴母亲中体现最明显,提示可能存在性别上的关联。   
近年来,邻苯二甲酸酯类被公认为是一种环境内分泌干扰物,在体内会干扰人体的内分泌系统,它的毒性作用的主要靶器官是雄性生殖系统[20]。有研究指出,孕妇体内的邻苯二甲酸酯浓度越高,产下的男婴生殖器官阴茎短小、阴茎先天畸形、尿道下裂与隐睾症的风险就越高。孕期PAEs的暴露程度将会影响胎儿脐血中睾丸甾体激素的水平[21]。英国的一项研究表明,邻苯二甲酸二丁酯(DBP)及它的代谢物邻苯二甲酸单丁酯(MBP)会抑制灵长类动物胎儿睾丸间质细胞中类固醇的生成[22]。因此,本实验中这种性别上的关联也在一定程度上印证了PAEs的雄性生殖发育毒性。
本研究中,笔者发现产妇尿液中PAEs代谢物的水平与11βHSD2活性之间存在关联,为PAEs胚胎毒性的机制性研究提供了线索,为评估母尿11βHSD2的活性能否作为PAEs暴露的早期生物学指标提供了理论基础。

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