中华预防医学杂志    2014年09期 纳米二氧化钛短期经口染毒对幼年大鼠骨髓细胞的遗传损伤作用    PDF     文章点击量:3833    
中华预防医学杂志2014年09期
中华医学会主办。
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王云 陈章健 巴特 濮吉 顾永恩 郭健 贾光
WangYun,ChenZhangjian,BaTe,PuJi,GuYongen,GuoJian,JiaGuang
纳米二氧化钛短期经口染毒对幼年大鼠骨髓细胞的遗传损伤作用
中华预防医学杂志, 2014,48(9)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.09.014
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投稿日期: 2013-11-21
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纳米二氧化钛短期经口染毒对幼年大鼠骨髓细胞的遗传损伤作用
王云 陈章健 巴特 濮吉 顾永恩 郭健 贾光     
王云 100191 北京大学医学部公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系
陈章健 100191 北京大学医学部公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系
巴特 100191 北京大学医学部公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系
濮吉 100191 北京大学医学部公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系
顾永恩 100191 北京大学医学部公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系
郭健 100191 北京大学医学部公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系
贾光 100191 北京大学医学部公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系
摘要: 目的  探讨纳米二氧化钛灌胃染毒对幼年大鼠骨髓细胞的遗传损伤作用。方法  将28只清洁级雄性SD幼年大鼠(4周龄),按体重以随机数字表法分为4组(每组7只),每天1次灌胃,分别给予0、10、50、200 mg/kg纳米二氧化钛[(75±15) nm,锐钛矿],染毒30 d后取骨髓细胞涂片,进行微核试验和γ–H2AX免疫荧光检测。结果  50 mg/kg纳米二氧化钛染毒组大鼠的γ–H2AX焦点阳性细胞率[(37.4±10.0)%],明显高于对照组[(19.8±3.1)%],差异有统计学意义(t=–17.59,P<0.01)。各染毒组大鼠与对照组相比,骨髓嗜多染红细胞与正染红细胞的比值(PCE/NCE)和嗜多染红细胞微核率无明显变化。结论  短期经口摄入纳米二氧化钛,可导致幼年大鼠骨髓细胞DNA双链断裂增加,但对骨髓细胞微核无明显影响。
关键词 :纳米粒;钛;大鼠;DNA损伤;安全
WangYun,ChenZhangjian,BaTe,PuJi,GuYongen,GuoJian,JiaGuang     
Department of Occupational and Environmental Health Sciences, School of Public Health, Peking University Health Science Center, Beijing 100191, China
Corresponding author: Jia Guang, Email: jiaguangjia@bjmu.edu.cn
Abstract:Objective  To explore the genotoxic effects of oral-exposed TiO2 nanoparticles on bone marrow cells in young rats.Methods  Twenty-eight SD male young rats (4 weeks old) were randomly divided into 4 groups, which were exposed to TiO2 nanoparticles ((75±15) nm, anatase) through intragastric administration at 0, 10, 50 and 200 mg/kg body weight (bw) every day for 30 days. The bone marrow cells were collected for micronuclei and γ-H2AX immunofluorescence analysis.Results  The percentage of γ-H2AX foci-positive cells (37.4±10.0)% in the 50 mg/kg bw dose group were significantly higher than that in the control group (19.8±3.1)% (t value was -17.59, P<0.01). No significantly difference was found in polychromatic erythrocyte/normochromatic erythrocyte (PCE/NCE) ratio and PCE micronucleus rate between three experimental groups and control group.Conclusion  TiO2 nanoparticles can increase the frequency of DNA double-strand breaks in bone marrow cells, but has no effect on micronucleus of bone marrow cells in young rats.
Key words :Nanoparticles;Titanium;Rats;DNA damage;Safety
全文

二氧化钛(E171)作为白色素在食品添加剂领域具有广泛用途,其中尤以糖果类食品中用量最多,故喜爱甜食的儿童成为高暴露人群[1,2]。虽然我国对食用二氧化钛材料的理化性质(GB 25577–2010)和食品中最大使用量(GB 2760–2011)做出了明确规定,但并未规定颗粒粒径大小。近期研究显示,食品级二氧化钛(E171)原料中有36%的颗粒处于纳米尺度[2],从口香糖中提取的二氧化钛,粒径处于纳米尺度的颗粒占93%[3]。纳米二氧化钛的小尺寸、高遮盖力和良好光泽度等特点,起到了明显改善食品口感和提升食品质量的作用,在食品添加剂领域表现出广阔的应用前景[4]。随着纳米材料安全性研究的不断深入,纳米特性所导致的独特生物学作用引起人们极大关注,常规材料的安全性数据可能不适用于纳米材料,有必要对纳米二氧化钛的食用安全性进行重新评价[5]。鉴于癌症研究国际机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)将二氧化钛归类为2B类可疑致癌物质,本研究拟从骨髓细胞染色体损伤和DNA损伤入手,揭示纳米二氧化钛经口染毒对幼年大鼠的遗传损伤作用,为进一步完善纳米二氧化钛的安全性数据库提供资料数据,并为纳米二氧化钛的有效管理与安全应用提供依据。

材料与方法  

1.纳米材料:  纳米二氧化钛购于上海晶纯实业有限公司(阿拉丁试剂),材料纯度为99.9%,晶体结构为锐钛矿型,近球形颗粒,粒径为(75±15)nm;将纳米二氧化钛悬浮于蒸馏水中(终浓度1 mg/ml),40 kHz超声波分散15 min后涡旋混匀,其水合粒径和Zeta电位值分别为473.6 nm和–33.46 mV,详见文献[6,7]。材料符合食品安全国家标准(GB 25577–2010)要求,可作为食品添加剂使用。

2.实验动物:  28只清洁级雄性Sprague–Dawley(SD)大鼠(3周龄,体重50~60 g),购买并饲养于北京大学医学部实验动物科学部[许可证号:SCXK(京)2011–0012,SYXK(京)2011–0039]。适应性饲养1周后,按体重以随机数字表法分为4组,每组7只。

3.大鼠灌胃染毒:  调查显示,成人平均每天经食品摄入二氧化钛量为5 mg左右(约0.1 mg/kg)[8]。参照《食品安全性毒理学评价程序》(GB15193.1–2003),采用人体摄入量的100倍,即10 mg/kg,作为最低暴露剂量。将纳米二氧化钛悬浮于蒸馏水中,使用前40 kHz超声波分散15 min并涡旋混匀。根据动物体重,4组实验大鼠分别以0、10、50、200 mg/kg剂量给予纳米二氧化钛悬液灌胃(灌胃体积为1 ml/只),每天1次,持续30 d,隔日更换新鲜配制的纳米二氧化钛染毒液。每日观察动物一般情况,每周称重。染毒期间,未见动物明显异常表现,各实验组动物体重无明显差异[6,7]

4.骨髓涂片:  染毒30 d后处死大鼠,取两侧股骨。250 μl小牛血清冲洗股骨骨髓腔,制成细胞悬液,细胞均匀涂布于洁净玻璃片上。待涂片自然干燥后放入甲醇中固定5~10 min,晾干置于切片盒内保存。

5.微核试验:  骨髓细胞涂片放入Giemsa应用液中染色10~15 min,蒸馏水冲洗晾干后,显微镜下读片。每只动物计数1 000个嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte,PCE),观察含有微核(micronucleus,MN)的嗜多染红细胞(MNPCE)数,计算微核率(MNPCE/PCE)。同时观察200个红细胞中嗜多染红细胞(PCE)与正染红细胞(normochromatic erythrocyte,NCE)的比值(PCE/NCE)。

6.γ–H2AX免疫荧光检测:  骨髓细胞涂片放入体积分数为0.1%Triton X–100破膜15 min后,PBS洗3次;体积分数为10%的马血清室温封闭1 h,1∶500稀释的多克隆兔抗γ–H2AX抗体(美国Abcam公司)4 ℃过夜,PBS洗3次;1∶100稀释的罗丹明标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)孵育2 h,PBS洗3次;Hoeschst 33342染色10 min,PBS洗3次,采用体积分数5%甘油封片。荧光显微镜下观察,计算含有γ–H2AX焦点的细胞比例,即γ–H2AX焦点阳性细胞率(%)。

7.统计学分析:  采用SPSS 12.0软件分析。各剂量组的生物学指标数值,经单样本K–S检验,服从正态分布的数据以±s表示。各测定指标的多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(one–way ANOVA),方差齐时组间两两比较采用LSD–t检验,方差不齐时组间两两比较采用Games–Howell检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.纳米二氧化钛对幼年大鼠PCE/NCE比值的影响:  如表1所示,3个纳米二氧化钛染毒组的幼年大鼠PCE/NCE比值低于对照组,其中尤以50 mg/kg纳米二氧化钛暴露组PCE/NCE比值最低,但该差异并无统计学意义。提示幼年大鼠经口染毒10、50、200 mg/kg纳米二氧化钛30 d后,对骨髓红细胞系统的增殖并未产生明显抑制。

表1纳米二氧化钛对幼年大鼠PCE/NCE比值的影响(±sn=7)

2.纳米二氧化钛对幼年大鼠骨髓细胞微核率的影响:  如表2所示,经口染毒10、50、200 mg/kg纳米二氧化钛30 d后,幼年大鼠骨髓嗜多染红细胞的微核率差异无统计学意义(P>0.05)。说明幼年大鼠经口染毒10、50、200 mg/kg纳米二氧化钛30 d后,并未导致骨髓细胞微核发生明显改变。

表2纳米二氧化钛对幼年大鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响(±sn=7)

3.纳米二氧化钛诱导幼年大鼠骨髓细胞γ–H2AX焦点的形成:  如表3所示,经口染毒50 mg/kg纳米二氧化钛30 d,幼年大鼠骨髓细胞中含有γ–H2AX焦点的细胞比例,高于对照组(P<0.01)。提示经口摄入纳米二氧化钛可诱导幼年大鼠骨髓细胞DNA双链断裂的发生。

表3纳米二氧化钛诱导幼年大鼠骨髓细胞γ–H2AX焦点的形成(±sn=3)

讨论  骨髓细胞微核实验是一种目前广泛应用于遗传毒性检测的快速、简便方法,主要通过微核率和PCE/NCE比值的变化来反映化学物质的遗传毒性和细胞毒性,其中遗传毒性主要体现在化学物质对染色体或有丝分裂器(纺锤体)的损伤作用。当细胞发生DNA双链断裂时,可诱导组蛋白H2AX的磷酸化(γ–H2AX)和簇集,在DNA双链断裂位点形成γ–H2AX焦点,故γ–H2AX焦点形成是DNA双链断裂的标志。研究显示,C57Bl/6J pun/pun雄性小鼠连续5天饮水暴露纳米二氧化钛(25 nm,金红石–锐钛矿混晶型),在摄入总量为50 mg/kg二氧化钛水平下即可观察到小鼠骨髓细胞中γ–H2AX焦点阳性细胞率升高[9];CBAB6F1雄性小鼠连续7天灌胃染毒纳米二氧化钛(33 nm和160 nm,锐钛矿型),可导致骨髓细胞彗星尾部DNA含量(染毒剂量为每天40、200 mg/kg)和嗜多染红细胞微核率升高(仅160 nm,染毒剂量为每天1 000 mg/kg)[10]。可见,经口摄入纳米二氧化钛可导致小鼠骨髓细胞发生遗传损伤作用,通过遗传毒性试验研究,有利于更全面地评价纳米二氧化钛的食用安全性。
        本课题组在前期研究发现,幼年和成年SD雄性大鼠经灌胃染毒纳米二氧化钛,可表现出显著不同的毒性效应,其中幼年大鼠更易感,肝脏和心脏都明显受损[7]。为进一步揭示纳米二氧化钛对易感年龄对象的毒性作用,笔者采用多次灌胃染毒的方式,探讨了连续30 d经口摄入不同剂量(10、50、200 mg/kg)纳米二氧化钛对幼年雄性大鼠骨髓细胞的遗传损伤作用。结果显示,纳米二氧化钛可诱导γ–H2AX焦点阳性细胞率升高,但微核率和PCE/NCE比值无明显变化,说明经口摄入纳米二氧化钛对幼年大鼠骨髓细胞的损伤作用主要表现为DNA双链断裂。但纳米二氧化钛的遗传毒性并无剂量–效应关系,仅在50 mg/kg中剂量暴露水平下观察到γ–H2AX焦点阳性细胞率升高,差异有统计学意义。200 mg/kg高剂量染毒组遗传毒性效应差异无统计学意义,其可能原因是剂量过高引起纳米二氧化钛大量团聚,进而导致其经胃肠道吸收转运量减少和对机体的损伤作用降低。结合上述C57Bl/6J pun/pun雄性小鼠和CBAB6F1雄性小鼠实验结果[9,10],提示单链或双链DNA断裂(彗星试验、γ–H2AX焦点形成)是纳米二氧化钛遗传毒性的典型表现。
        综上所述,短期经口摄入纳米二氧化钛,可导致幼年大鼠遗传损伤,使骨髓细胞发生DNA双链断裂。虽然纳米二氧化钛导致DNA损伤的具体机制有待进一步研究,但该研究提示我们应关注纳米二氧化钛的遗传毒性,并慎重对待纳米二氧化钛在食品领域的推广使用。为保障人民群众尤其是儿童身体健康,应加强纳米二氧化钛的毒理学研究,尽快明确纳米二氧化钛的食用安全性,以指导纳米二氧化钛在食品领域中的安全应用。

参考文献
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