中华预防医学杂志    2014年09期 肠道病毒71型灭活疫苗临床试验的现状及展望    PDF     文章点击量:4075    
中华预防医学杂志2014年09期
中华医学会主办。
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嵇红 毛群颖 王慎玉 朱凤才
肠道病毒71型灭活疫苗临床试验的现状及展望
中华预防医学杂志, 2014,48(9)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.09.017
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投稿日期: 2014-04-30
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肠道病毒71型灭活疫苗临床试验的现状及展望
嵇红 毛群颖 王慎玉 朱凤才     
嵇红 210009 南京,江苏省疾病预防控制中心疫苗临床评价所
毛群颖 中国食品药品检定研究院
王慎玉 东南大学公共卫生学院
朱凤才 210009 南京,江苏省疾病预防控制中心疫苗临床评价所
摘要:
关键词 :
    

Abstract:
Key words :
全文

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)在1969年首次从美国加利福尼亚州患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来后(BrCr株,A型)[1],美国、日本、保加利亚、匈牙利、澳大利亚、马来西亚、中国、新加坡、韩国、越南、柬埔寨等国家均曾报道过EV71感染引起的手足口病暴发流行[2,3]。EV71属于小RNA病毒,只有一个血清型[4],其感染所致疾病临床表现复杂多样,病情轻重不一,包括手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎、偏瘫、急性呼吸道症状和心肌炎等[5]。EV71感染是引起重症及死亡病例的主要病原体[6,7,8,9]。手足口病的流行已成为我国及东南亚国家的重大公共卫生问题之一,造成极大的经济及社会负担[7,8,10,11,12,13]
        目前,EV71感染尚无特效的治疗药物,疫苗可能成为最有效的预防措施,而在各类EV71疫苗中,灭活疫苗的研究进展最快。目前,亚洲已有分别来自中国大陆、中国台湾、新加坡的五家机构和公司进入EV71灭活疫苗的临床试验阶段。

一、EV71疫苗临床前研究情况  

(一)EV71疫苗免疫动物诱导产生中和抗体和相应的细胞免疫  大量研究表明,EV71感染或疫苗免疫动物后产生的抗体具有中和病毒活性[14,15]。EV71疫苗免疫母鼠后,母传抗体可对毒株攻击的乳鼠具有一定的保护作用;在应用致死剂量毒株攻击乳鼠后的不同时间内被动免疫EV71中和抗体,不同免疫剂量可使乳鼠获得不同的保护效果[14,16]。这些研究进展提供了EV71候选疫苗免疫效果的依据,为EV71疫苗研发的成功奠定了一定的基础。
        除中和抗体外,EV71疫苗诱导的细胞免疫应答也具有免疫保护作用,病毒样颗粒(VLP)疫苗免疫小鼠的脾细胞体外刺激可产生高水平的干扰素(IFN)–γ、白介素(IL)–2和IL–4[15]。在VP1区域发现细胞免疫表位位点,而在VP2、VP3区域也存在数个细胞免疫表位,通过免疫记忆发挥抗病毒再次感染的作用。
        评价疫苗有效性的主要指标应是疫苗接种后由B细胞介导产生的中和抗体。在小鼠实验中证实,缺乏CD4 T细胞的小鼠抵抗EV71感染的能力与正常小鼠相当,而B细胞缺乏的小鼠则比正常小鼠更容易受到EV71的感染[17]。有研究表明,B细胞介导的体液免疫对于预防及控制EV71感染和发病具有重要作用[18]

(二)多种类型候选EV71疫苗的临床前研发情况  目前已研发的EV71疫苗主要包括全病毒灭活疫苗[19]、EV71 VLP疫苗[15]、重组VP1蛋白疫苗(亚单位疫苗)[14]、VP1 DNA疫苗[20]、VP1多肽疫苗、细菌或病毒载体表达的VP1疫苗[21,22],Vero细胞培养的减毒活疫苗[23],以及VP1基因转入西红柿制备的转基因疫苗[24]等。在众多候选疫苗中,减毒活疫苗虽然能够诱导产生广泛的中和抗体反应,但因疫苗本身很难做到完全减毒,仍存在安全隐患;重组疫苗和DNA疫苗则仍面临抗原表达水平相对较低的问题。相比而言,灭活疫苗有较强的免疫原性和较好的安全性,灭活疫苗能在小鼠中诱导广泛的中和反应,能够保护小鼠和猴子耐受攻毒,是较为理想的EV71候选疫苗,其次则为VLP疫苗[25,26]

二、人群感染EV71产生中和抗体的流行状况及其作用  目前尚无EV71存在重复感染的报道。仅有少量报道显示,在同1例手足口病病例中存在复发从而增加感染病程的情况,主要是由于感染了不同肠道病毒血清型所致。潘浩等[27]通过对某福利院首起暴发疫情研究结果显示,3例病例在首次暴发疫情为EV71感染,间隔2个月后再次发病,为柯萨奇病毒A组16型(coxsakievirus A16,CVA16)感染;Sutton–Hayes等[28]2006年报告1例15岁病例在3周后再次发病的情况,也是因为前后感染了不同的病毒株。
        人群血清流行病学调查显示,父母双方携带EV71抗体的血清阳性率与新生儿血清抗体阳性率相关[29,30,31],但新生儿虽然能够从母体获得EV71中和抗体,该母传抗体的存在时间却是短暂的。新加坡、中国台湾、马来西亚、德国、中国大陆(江苏、河南、广东、云南、湖南等)血清流行病学研究结果均显示,新生儿携带的EV71母传抗体会在出生1个月后迅速下降,6月龄至2岁儿童的血清抗EV71抗体阳性率最低(低于30%);5岁后血清阳性率的比例达到稳定的状态(50%以上),之后抗EV71抗体水平则随着年龄的增加而下降[29,32,33,34,35,36,37]。江苏975名婴幼儿抗EV71母传抗体回顾性队列研究显示[37],EV71母传抗体水平在7月龄时显著下降,并维持相对较低的水平,12月龄到27~38月龄期间,EV71中和抗体水平显著上升;观察期间手足口病累计发病密度为5 080/10万人年,在14月龄后显著上升。Chang等[29]研究显示,流行前特定年龄EV71血清阳性率与肠道病毒相关的死亡率、严重病例发生率呈负相关。
        高远征等[38]研究表明,应用抗–EV7阳性血浆联合小剂量人免疫球蛋白治疗重症手足口病,能显著缩短症状的改善时间。提示补充EV71中和抗体对EV71引起的中枢神经感染有一定的疗效。
        上述研究表明,人群首次感染EV71后产生中和抗体可能预防EV71再次感染,6月龄至3岁儿童缺乏EV71保护性抗体是这个年龄组高感染率和高病死率的主要原因,为EV71疫苗研制的必要性和目标人群的选择提供了科学依据,也为EV71疫苗成功研发提供了可行性依据。

三、EV71病原的基因分型及其交叉免疫  EV71病毒可根据VP1序列和VP4的变异情况,分为3个基因型(A、B和C型)和11个基因亚型(BrCr、B1–B5和C1–C5亚型)。1998年以来,中国的EV71分离株多属于C4基因型[39,40];中国台湾、日本、新加坡众多研究结果表明,EV71不同基因型、亚型可在同一地区、同一时期共同流行,同一地区不同时间流行的EV71常发生基因型转换,不同基因型和亚型对于流行的"贡献"可能发生改变[41,42,43,44,45],因此理想的EV71疫苗还应具有抗原谱广的特点。
        中国医学科学院医学生物学研究所(简称昆明所)采用人二倍体细胞KMB17制备的EV71灭活疫苗对乳鼠模型和幼恒河猴模型进行保护力试验[46],结果显示,疫苗能对同型病毒攻击动物提供100%的保护,并且对C2、C4、A型株(BrCr)的中和活性差异在5倍以内,显示出良好的免疫原性与广谱保护性。Mao等[47]研究结果表明:2针次C4株EV71灭活疫苗接种后,92.5%(49/53)的免疫前阴性受试者和98.1%(52/53)的免疫前阳性组受试者对B4、B5、C2、C4以及C5均产生了良好的交叉免疫,96.07%(49/51)自然感染EV71婴幼儿对上述5种EV71基因型的中和活性差异在4倍以内。疫苗接种诱导产生的交叉免疫与自然感染产生的交叉免疫未表现出反应率的差别。Chou等[48]研究结果表明,超过85%接种B4基因型EV71疫苗的受试者产生对EV71的B1、B5和C4A基因型较强的交叉免疫,而仅有约20%的受试者产生对C4B和CVA16微弱的交叉免疫。这些结果显示,EV71疫苗对EV71的不同基因型或亚型病毒有交叉免疫,对非EV71如CVA16无或仅有非常弱的交叉免疫。
        此外,Zhu等[49]对480名脊髓灰质炎疫苗免疫史的婴幼儿在接种EV71疫苗后第0、28和56天的血液标本进行抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型抗体水平检测后发现,婴幼儿常规接种口服脊髓灰质炎减毒活疫苗未对接种EV71疫苗的免疫应答水平产生干扰。

四、EV71灭活疫苗的安全性、有效性与保护效果  目前,中国大陆3家生物制品公司,即北京微谷生物医药有限公司(简称北京微谷)、北京科兴生物制品有限公司(简称北京科兴)、昆明所,研发的C4株EV71灭活疫苗均已在2011–2013年期间完成了Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期临床试验[49,50,51,52,53,54,55,56];中国台湾[57](中国台湾"国立"卫生研究院)B4株EV71灭活疫苗以及新加坡(Invitrogen Pte. Ltd)研制的EV71灭活疫苗分别于2011、2012年陆续进入Ⅰ期临床试验,详见表1

表1不同企业研发的EV71灭活疫苗及其各期临床试验研究设计、研究人群、免疫程序和剂量分组

(一)EV71疫苗的安全性  北京微谷研制的EV71疫苗的Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期安全性数据均表明,该EV71灭活疫苗具有良好的安全性和耐受性[49,50,54,56]。所观察到的绝大多数不良反应均为轻度或中度,并在疫苗组和安慰剂组之间呈现均衡分布,未观察到不良反应的发生随剂量升高而增多的剂量–反应关系,Ⅰ期、Ⅱ期临床试验中观察到部分受试者接种后出现了与疫苗接种无关的一过性血生化或尿常规变化,较为常见的局部不良反应为硬结或疼痛,全身不良反应则为发热。北京科兴研制的EV71疫苗Ⅰ期、Ⅱ期临床试验安全性观察结果[53,55],以及中国台湾"国立"卫生研究院研制的EV71疫苗的安全性观察数据与上述安全性观察结果类似[57]
        在北京微谷研制疫苗的Ⅰ期临床试验结果显示[56]:13~60月龄受试者不良反应的发生率低于6~12月龄受试者;该疫苗Ⅱ期临床试验中观察到含铝佐剂的疫苗组注射部位的局部不良反应发生率高于无铝佐剂疫苗组,特别是含佐剂高剂量组640 U疫苗组硬结发生率高于无佐剂640 U疫苗组[50],提示疫苗中添加铝佐剂可增加注射部位硬结等局部不良反应发生率。而北京科兴研制EV71疫苗的Ⅰ、Ⅱ期临床试验中,除Ⅱ期临床试验中观察到首针接种后200 U剂量组中12~35月龄总体不良反应的发生率显著低于6~11月龄外,不同年龄组、不同剂量疫苗组与安慰剂组间不良反应发生率差异均无统计学意义[53,55]

(二)EV71疫苗的免疫原性  EV71疫苗为新型病毒疫苗,鉴于中和抗体曾成功地应用于诸如脊髓灰质炎疫苗、甲型肝炎疫苗的免疫学效果评价[58,59,60],因此,针对EV71疫苗免疫原性的评价主要也采取中和抗体相关评价指标。
        北京微谷和北京科兴研制的EV71疫苗在较少人群的Ⅰ期临床结果显示,对于青少年中免疫前中和抗体阳性的受试者,1针次免疫后即可产生较高水平的中和抗体,2针次接种后则不再出现明显的免疫反应增强[54,55,56],提示该人群仅需接种1针次即可;而对于免疫前阴性的婴幼儿受试者,第2针免疫之后则观察到了显著的免疫反应增强,则提示3岁以下的儿童应按照第0、28天接种2针次。因此,针对EV71疫苗的最佳目标人群,即6~35月龄儿童,第0、28天2针次的免疫接种程序应为初免最佳免疫程序。Cheng等[57]对中国台湾"国立"卫生研究院研制的EV71疫苗实施的Ⅰ期临床试验结果与上述结果类似,即20~60岁人群接种1针次5 μg EV71抗原或10 μg EV71抗原,即均能产生良好的免疫原性。
        北京微谷研制EV71疫苗在1 200名6~35月龄的婴幼儿中实施的Ⅱ期临床试验结果显示,在免疫前抗体阴性的受试者中,3个铝佐剂疫苗组免疫原性表现出一定的剂量–反应关系,且与无佐剂疫苗相比,含佐剂疫苗能激发出更强的免疫应答[49]。提示铝佐剂的添加能够有效增强疫苗的免疫原性。北京科兴研制EV71疫苗的Ⅱ期临床试验[53]亦显示类似剂量–反应关系。北京微谷[50]、北京科兴[51]和昆明所[52]研制的EV71疫苗的免疫原性在Ⅲ期大样本临床试验中得到了进一步的验证,与安慰剂组相比,2针次EV71疫苗接种可引起中和抗体滴度的明显升高,疫苗组抗EV71中和抗体几何平均滴度(GMT)始终显著高于安慰剂组。
        北京微谷所研制EV71疫苗接种后免疫原性结果显示,在首针接种后第8个月,尽管不同剂型、剂量疫苗组抗体阳转率仍维持与第2针接种后第28天几乎相同水平,但抗体滴度均呈现较大幅度的下降,GMT从1∶210.3~1∶1 383.2下降至1∶58.8~1∶177.4[49];北京科兴和昆明所所研制EV71疫苗的临床研究中亦观察到抗EV71中和抗体存在类似的衰减规律[51,52,53]。在北京微谷EV71疫苗Ⅱ期临床试验建立的队列基础上开展的加强免疫研究于2012年实施[61],共纳入773名接种EV71疫苗的受试者,结果提示,EV71疫苗基础免疫后1年1针次加强免疫表现出良好免疫原性和安全性,加强免疫后第28天,4个剂量、剂型的EV71疫苗(160 U含佐剂、320 U含佐剂、640 U含佐剂和640 U无佐剂组)均诱导了较强的免疫反应,GMT从免疫前的1∶138.2~1∶264.3增高到了免疫后的1∶2 214.8~1∶4 410.7,与初次免疫2针次后相比,GMT增幅更大,而相较之下安慰剂组几乎未能诱导或仅诱导了极弱的免疫反应。

(三)EV71疫苗的保护效果  2013年5月,Zhu等[50]首次报道了EV71灭活疫苗Ⅲ期临床试验的有效性评价,并探索了疫苗的免疫学替代终点。该研究对9 846名婴幼儿进行了免疫后1年的主动监测,结果提示试验疫苗对EV71感染所致手足口病的保护率为90.0%,对EV71感染所致疾病(包括手足口病、神经系统并发症如脑炎、脑膜炎以及其他非特异性疾病)的保护率为80.4%,对EV71感染所致手足口病住院病例或重症病例的保护率则为100.0%,其保护率与其他的肠道病毒灭活疫苗(如灭活脊髓灰质炎病毒疫苗)相似[62,63]。该项研究还应用灵敏度、特异度和约登指数等指标对免疫学替代终点进行了探索,研究者建议将中和抗体滴度1∶32作为疫苗保护性的免疫学替代终点,为EV71所致疾病的保护性抗体水平的建立提供了首要证据。
        2014年,Zhu等[51]、Li等[52]分别报道了北京科兴和昆明所研制EV71灭活疫苗的有效性评价结果。北京科兴所研制EV71疫苗对EV71感染所致手足口病、疱疹性咽峡炎的保护率为94.8%,对EV71感染所致住院病例和EV71感染所致重症病例的保护率均为100.0%;昆明所研制的EV71疫苗对EV71感染所致手足口病的保护率为97.3%。此外,Li等[53]的报道中还提出评价EV71疫苗的免疫学替代终点的中和抗体滴度应≥1∶16,与其于2013年报道的北京微谷研制EV71疫苗Ⅲ期临床试验结果相似。

五、EV71灭活疫苗研发及应用需要面对的问题  

(一)疫苗免疫持久性及保护性抗体水平的评价  中国大陆3家企业所研制EV71疫苗的Ⅲ期临床研究结果均显示EV71灭活疫苗具有良好的安全性、免疫原性及保护效果。但目前仍有一些问题还未明确,如疫苗的长期免疫持久性如何等。此外,如果EV71疫苗获批上市并进行大规模接种,保持易感人群中的抗EV71中和抗体在一定水平,可改变易感人群积累的速度以及病毒流行的规律,使得自然感染减少甚至消失,从而导致目前状态下因自然感染而获得预存抗体从而不易感染的人群抗体水平下降,而变成新的易感人群。因此,加强免疫的剂量以及免疫时间点问题还需要进一步的探讨和优化。最后,对于免疫后无应答人群的比率、再次免疫后是否可以出现应答等问题也要高度关注。这些问题需要在疫苗上市后进行进一步的研究。

(二)EV71进化重组可能对疫苗的影响  2008年Huang等[64]在中国台湾EV71流行时研究发现一个新的亚型––类C2亚型,该亚型可能由C2和B3亚型重组产生。使用11份感染EV71(B4、B5、C4、C5)病例的急性期和恢复期血清进行中和试验,结果表明,与其他亚型相比,中和血清对类C2亚型的病毒中和能力普遍较差,最大差别可达到128倍。我国大陆所使用的疫苗株均为C4亚型,目前研究表明其对其他亚型的病毒具有较好的交叉保护作用。但是EV71复制依靠依赖RNA的RNA聚合酶,缺乏校正功能,如果存在两种以上肠道病毒共同流行时,则可能发生病毒的基因重组,很可能会成为某一阶段的优势流行株。进化重组给EV71疫苗的保护效果提出了新的挑战,有必要对EV71流行基因型进行长期的监测,并对新的亚型进行交叉免疫研究。

(三)EV71疫苗可能纳入国家扩大免疫规划(EPI)的研究  WHO制定的《疫苗纳入指南:将疫苗纳入国家免疫规划的决策与实施》[65]中指出,将新的疫苗纳入国家免疫规划需多层面、多领域的证据支持,需综合疫苗所针对疾病负担、公共卫生优先权限、经济及财政预算、疫苗生产供应能力等多方面研究数据和调查信息的考虑。目前,中国大陆三家企业所研制EV71疫苗的临床评价已完成,其安全性、免疫原性和有效性也得到了较好的验证[49,50,51,52,53,54,55,56];应通过国家疾病监测数据库分析[13]、文献系统综述、血清流行病学研究、手足口病重症后遗症研究、疾病负担等研究,从操作层面和技术层面对公共卫生优先事项进行全面评估。

(四)联合疫苗的研发及EV71疫苗与其他EPI疫苗的相互作用  手足口病可由多种病原引起,以往的研究表明,EV71及CVA16感染为手足口病的常见病原体。而近年来的研究结果则显示,由其他肠道病毒感染引起的手足口病呈现逐渐上升的趋势,已经引起世界各国的关注和警惕,如2007–2012年CVA6所致的手足口病在新加坡、芬兰、中国台湾、美国、日本、法国、印度等国家和地区相继暴发[66,67]。而EV71疫苗的Ⅲ期临床结果显示,EV71 C4基因型疫苗对常与EV71同时流行并可导致手足口病的CVA16没有交叉保护作用[48]。因此,尽管该试验疫苗针对EV71感染所致手足口病有较高的保护率,其对总体手足口病发病的预防作用有限,针对EV71与其他肠道病毒的联合疫苗的研发可能是未来研究的关注点。
        此外,EV71疫苗的目标接种人群为6~35月龄婴幼儿,而该人群需要进行多种类多剂次的扩大免疫规划疫苗的接种,这些疫苗与试验EV71疫苗的相互作用也仍需进一步的研究探讨。

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