中华预防医学杂志    2015年12期 2013–2014年宁夏回族自治区柯萨奇病毒A10型分离株VP1区基因特征    PDF     文章点击量:3150    
中华预防医学杂志2015年12期
中华医学会主办。
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马江涛 袁芳 林虹 陈慧 马学旻 詹军
MaJiangtao,YuanFang*,LinHong,ChenHui,MaXuemin,ZhanJun
2013–2014年宁夏回族自治区柯萨奇病毒A10型分离株VP1区基因特征
Genetic characteristics of VP1 region of coxsackievirus A10 strains in Ningxia Hui Autonomous Region during 2013-2014
中华预防医学杂志, 2015,49(12)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2015.12.008
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投稿日期: 2015-06-01
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2013–2014年宁夏回族自治区柯萨奇病毒A10型分离株VP1区基因特征
马江涛 袁芳 林虹 陈慧 马学旻 詹军     
马江涛 750004 银川,宁夏疾病预防控制中心病毒科
袁芳 750004 银川,宁夏疾病预防控制中心病毒科
林虹 宁夏医科大学公共卫生学院流行病与统计学教研室
陈慧 750004 银川,宁夏疾病预防控制中心病毒科
马学旻 750004 银川,宁夏疾病预防控制中心病毒科
詹军 750004 银川,宁夏疾病预防控制中心病毒科
摘要: 目的  分析宁夏回族自治区(宁夏)手足口病病例中柯萨奇病毒A10型(CV-A10)分离株的基因特征。方法  于2013年1月–2014年12月,利用手足口病实验室网络监测系统,采集宁夏各市、县到当地人民医院就诊的手足口病病例标本,共采集2 470份,其中粪便标本450份,咽拭子2 020份。使用人横纹肌肉瘤细胞进行病毒分离,获得的各种毒株用兼并引物进行VP1区基因扩增和序列测定。测序结果利用Blast进行病毒型别鉴定后,对鉴定为CV-A10的所有毒株进行同源性和系统进化分析。结果  共收集到非EV-A71和非CV-A16的肠道病毒标本450份,分离到CV-A10 36株,其中,2013年6株,2014年30株。36株毒株间的核苷酸和氨基酸同源性分别为90.6%~100.0%和90.2%~100.0%。与A、B、C、D各型别代表株的同源性比较发现,36株毒株与C型代表株的核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为90.2%~98.9%和95.7%~99.7%。系统进化分析显示,36株宁夏CV-A10分离株与C基因型代表株处于同一分支。结论  CV-A10是引起宁夏地区手足口病的常见病原体,本次分离到的CV-A10均属于C基因型,具有较宽的同源性范围。
关键词 :手足口病;生物学监测;柯萨奇病毒感染;基因型
Genetic characteristics of VP1 region of coxsackievirus A10 strains in Ningxia Hui Autonomous Region during 2013-2014
MaJiangtao,YuanFang*,LinHong,ChenHui,MaXuemin,ZhanJun     
Department for Viral Disease Detection of Ningxia Center for Disease Control and Prevention, Yinchuan 750004, China
Corresponding author: Zhan Jun, Email: nx_zhanjun@126.com
Abstract:Objective  To investigate the genetic characteristics of coxsackievirus A10(CV-A10) strains isolated from hand, foot and mouth disease (HFMD) cases in Ningxia province.Methods  Based on the HFMD laboratory network surveillance system, 2 470 patients clinical specimens including 450 faeces and 2 020 throat swaps were collected from various regions people's hospital in Ningxia Hui Autonomous Region during January, 2013 to December, 2014. All specimens were isolated using rhabdomyosarcoma cells. VP1 regional gene of isolated strains was amplified by RT-PCR using degenerate primers and sequenced. Sequences were compared with the database of GenBank by the Blast algorithm to identify the enterovirus genotypes. All the CV-A10 strains were performed the homology and phylogenetic evolution analysis.Results  450 specimens identified as non-EV-A71, non-CV-A16 enterovirus were collected and 36 CV-A10 strains were isolated, 6 strains were isolated in 2013 and 30 strains were isolated in 2014. The homology of nucleotides and amino acids among 36 CV-A10 strains were 90.6%-100.0% , and 90.2%-100.0%, respectively. Compared 36 strains with genotype A, B, C, D representative strains, it has the highest homology with the genotype C, the nucleotide and amino acids homogeneity were 90.2%-98.9% and 95.7%-99.7%. The phylogenetic tree showed 36 strains and genotype C representative strains located in the same evolutionary branch.Conclusion  CV-A10 was one of the most common pathogen of HFMD in Ningxia Hui Autonomous Region. All CV-A10 strains belonged to genotype C and contained wide homology range.
Key words :Hand, foot and mouth disease;Biosurveillance;Coxsackievirus infections;Genotype
全文

手足口病是由人类肠道病毒引起的一种常见传染病,主要病原是肠道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71)和柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CV-A16)。近年来,由非EV-A71和非CV-A16的其他肠道病毒引起的病例逐渐增加[1,2],并且导致重症或死亡病例发生[3]。宁夏回族自治区(宁夏)2013–2014年的手足口病实验室监测中,CV-A10所占比例逐渐增大,2013年分离到CV-A10毒株6株,2014年分离到30株。针对CV-A10分离株大幅度增加的特点,本研究对2013–2014年宁夏分离到的CV-A10的VP1区基因特征进行了分析。

材料与方法  

1.标本来源:  于2013年1月至2014年12月,利用手足口病实验室网络监测系统,采集宁夏各市、县到当地人民医院就诊的手足口病病例标本,共采集2 470份,其中,粪便标本450份,咽拭子2 020份。

2.病毒核酸提取和鉴定:  所有标本按照国家《手足口病防治指南》(2009版)经过预处理后,取200 μl上清液,采用瑞士Roche公司的高纯度病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。采用江苏硕世生物科技公司生产的EV-A71、CV-A16和肠道病毒通用检测试剂盒进行病毒RNA分型检测。

3.病毒分离:  对鉴定为非EV-A71和非CV-A16的其他肠道病毒进行病毒分离。取200 μl标本上清液接种至刚长满单层、形态良好的人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma cells,RD),置36 ℃培养箱内,连续7 d观察细胞病变(cytopathogenic effect, CPE),当CPE≥75%时收获病毒;对未发生CPE变化的标本,盲传3代,若无CPE出现,判为阴性。

4.VP1区基因序列的获得:  收获的阳性毒株提取病毒RNA,根据文献[4],使用兼并引物对肠道病毒VP1区基因进行分段扩增。扩增试剂为北京全式金生物技术有限公司生产的一步法RT-PCR试剂盒,反应条件为:42 ℃ 45 min,95 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 80 s, 40个循环;72 ℃延伸10 min。琼脂糖电泳阳性的PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行核苷酸序列测定。

5.序列分析:  测序结果用SeqMan软件进行拼接,然后使用Blast进行病毒型别鉴定。将CV-A10原型株(Kowalik/USA/1950)和其他型别代表株[3]序列作为参考序列,对鉴定为CV-A10的分离株进行VP1区核苷酸与氨基酸同源性分析和系统进化分析。A型参考株为1株美国原型株,B型参考株包括14株法国分离株、1株俄罗斯分离株和1株西班牙分离株,C型参考株来源于我国山东、广东等地。同源性分析使用MegAlign软件,系统发生树构建使用Mega 6.0软件(建树的可靠性通过1 000 bootstrap来评估)。

结果  

1.分型鉴定:  共收集到非EV-A71和非CV-A16的肠道病毒标本450份,分离到肠道病毒毒株71株;其中,2013年28株,2014年43株。71株肠道病毒以CV-A10为主,2013年6株,2014年30株,共36株,其中,银川市9株、石嘴山市13株、吴忠市6株、固原市2株、中卫市6株;其他肠道病毒型别包括CV-A4(7株),CV-A6(5株),CV-A8(3株),CV-A14(3株),CV-B5(1株),EV-A11(2株),其余14株为未定型。

2.CV-A10分布特点:  本次共分离到CV-A10毒株36株,2013年分离到的6株仅来源于银川市和石嘴山市,2014年分离到的30株分别来源于宁夏各市,其中,银川市7株、石嘴山市9株、吴忠市6株、固原市2株、中卫市6株。

3.CV-A10宁夏株VP1区核苷酸及氨基酸序列分析:  每株病毒的2个片段测序序列拼接后,获得CV-A10分离株完整的VP1区基因序列(894 bp)。本次研究成功获得36株CV-A10宁夏株VP1区全长基因序列,与A型原型株的核苷酸和氨基酸同源性分别为73.2%~77.2%和90.3%~93.0%,与B型代表株的核苷酸和氨基酸同源性分别为77.9%~83.1%和93.2%~95.3%,与C型代表株的核苷酸和氨基酸同源性分别为90.2%~98.9%和95.7%~99.7%,与D型代表株的核苷酸和氨基酸同源性分别为75.8%~82.3%和90.4%~94.0%。36株分离株与C型代表株的核苷酸和氨基酸同源性最高,属于C型病毒。36株宁夏分离株之间的同源性差别较大,核苷酸同源性为90.6%~100.0%,氨基酸同源性为90.2%~100.0%,说明宁夏2013年和2014年流行的CV-A10具有较大的核苷酸变异(最大差异度为9.4%)和氨基酸变异(最大差异度为9.8%),而且不同年份间流行的毒株具有较宽的核苷酸序列同源性范围(90.6%~100%)。

4.CV-A10宁夏株亲缘进化分析:  通过系统发生树可以看出,本次分离到的36株CV-A10处于同一分支,同属于C型CV-A10病毒。从系统进化来看,宁夏流行的CV-A10与2012年河北流行的CV-A10(如KF246661-SJZ12-0338T/HeB/CHN/2012和KF246663-SJZ12-0741T/HeB/CHN/2012)具有很高的同源性,而与2008–2009年流行于山东(如GQ214173-H450F/SD/CHN/2008和GU947775-TA-E76/SD/CHN/2009)和2010年流行于江苏(JN639891-M10M6/JS/CHN/2010)的CV-A10毒株同源性不及2013年分离株,提示宁夏流行CV-A10和国内其他省份流行的CV-A10处于共循环状态,变异程度与流行年代有相关性。同时,宁夏流行的CV-A10具有明显的时间分布特点,2013年和2014年流行的毒株形成两支明显的分支,不同年份流行毒株的最大核苷酸差异度达到9.4%。
        从36株毒株进化特点来看,宁夏流行CV-A10形成5条不同的传播链,同一个传播链均由不同地区的毒株构成,而且这些毒株间核苷酸序列具有很大的相似性,表明CV-A10在宁夏存在有较广泛的分布和传播。传播链1和2分别由2013年石嘴山分离株(SZS13-011T/NX/CHN/2013、SZS13-012T/NX/CHN/2013、SZS13-025T/NX/CHN/2013、SZS13-034T/NX/CHN/2013)和银川分离株(YC13-075T/NX/CHN/2013、YC13-076T/NX/CHN/2013)构成,传播链3和5由2014年不同地区分离株构成,传播链4由2014年银川分离株(YC13-075T/NX/CHN/2014、YC13-165T/NX/CHN/2014)构成,见图1

图136株宁夏回族自治区柯萨奇病毒A10型分离株与各型代表株的VP1基因系统进化树

讨论  引起手足口病的病原体种类繁多,其主导病原体在不断地发生着变化。宁夏自2008年开展手足口病监测以来,优势病原体主要以EV-A71和CV-A16交替流行为主,2013年其他肠道病毒在病原中所占比例较大,为35.18%(280/796),2014年为17.73%(185/1 043)。随着EV-A71和CV-A16的广泛流行,通过自然感染而建立的免疫屏障达到一定的保护水平后,除EV-A71和CV-A16以外的其他肠道病毒的危害性会凸显出来[1,2,3,5],近年来,CV-A10、CV-A6和CV-B3等病毒逐渐演变为手足口病的常见病原体[6,7,8,9,10]。宁夏近年来手足口病病原中,非EV-A71和非CV-A16的肠道病毒在病原中所占比例变化幅度不大,而从2013–2014年的分型结果来看,CV-A10在非EV-A71和非CV-A16的肠道病毒中所占比例分别为21.43%和69.73%,说明CV-A10其中扮演了重要的角色,引起的危害不容忽视。
        根据CV-A10的VP1全基因序列,CV-A10被划分为4个基因型[3],包括A、B、C、D型别。A基因型仅有美国1株Kowalik原型株,与其他型别同源性差别较大。B型和C型主要发生在中国,根据文献资料,2008年以前中国CV-A10主要以B型为主,2008年以后常见C型流行[3,11,12]。D基因型主要包括国外一些国家分离到的毒株,比如西班牙2008年分离株[13]、法国2010年分离株[9]和俄罗斯2010年分离株[14]。从本次分离到的36株宁夏CV-A10毒株来看,同属于C型,这与2009年以后我国其他地区流行型别一致[3,6]。但是不同年份间流行的毒株具有较宽的核苷酸序列同源性范围(90.6%~100%),而且与C型代表株核苷酸差异度较大,而与B型代表株核苷酸的差异度较小。这一方面提示,宁夏流行CV-A10具有明显的时间差异性,不同年份流行的毒株形成了较为独立的进化分支;另一方面提示,宁夏流行CV-A10核苷酸变异速率较快,病毒基因型存在从C型向B型转变的可能,需要进一步加强监测。
        从我国不同地区、不同年代的CV-A10分离株VP1系统发生树来看,虽然宁夏流行的CV-A10与国内其他省份近年来的流行株同属C型。但从不同年代来看,宁夏2013–2014年流行的CV-A10与2012年河北流行株同源性较高,而与2008–2010年山东、2010年江苏等地流行株同源性较低。而且宁夏株进化形成了较为独立的进化分支,说明CV-A10核苷酸变异速率较快,需要加强监测。
        从本次研究结果来看,36株宁夏株没有明显的地域特征,在形成的5条的传播链上,有3条传播链(1、2和4)毒株较少,仅分别由银川分离株和石嘴山分离株构成外,其余2条传播链(3和5)均由不同地区的毒株构成,而且这些毒株间核苷酸序列具有很大的相似性,说明CV-A10在宁夏流行时间较长,存在有较广泛的分布和传播。从流行的5条传播链毒株构成来看,虽然CV-A10在宁夏各个地区处于共循环状态,但是部分石嘴山分离株和银川分离株往往形成相对比较独立的进化分支,例如传播链2和4分支仅由银川株构成,传播链3中有条相对独立的分支仅由石嘴山株构成,说明这两个地区的CV-A10分布具有一定的地域性。而且在2013年分离到的6株病毒中,银川市和石嘴山市两个地区的分离株处于不同的分支,提示CV-A10在银川市和石嘴山市可能存在更为广泛的分布和传播。
        CV-A10作为宁夏非EV-A71和CV-A16肠道病毒中最主要的病毒型别,在宁夏地区存在较为广泛的流行和传播,尤其随着近年来手足口病病原的变化[15,16],以及由CV-A10引起重症病例的不断增加,开展不同地区CV-A10基因特征研究,阐明其分布和流行规律,对于当地手足口病的防控具有重要的意义。

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