中华预防医学杂志    2015年12期 有害结局路径策略在毒理学研究中的发展和应用    PDF     文章点击量:5641    
中华预防医学杂志2015年12期
中华医学会主办。
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王艳华 段化伟
WangYanhua,DuanHuawei
有害结局路径策略在毒理学研究中的发展和应用
Development and application of adverse outcome pathway in toxicology research
中华预防医学杂志, 2015,49(12)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2015.12.019
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投稿日期: 2015-06-04
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有害结局路径策略在毒理学研究中的发展和应用
王艳华 段化伟     
王艳华 100050 北京,中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所化学污染与健康安全重点实验室
段化伟 100050 北京,中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所化学污染与健康安全重点实验室
摘要: 有害结局路径(AOP)是综合已有的毒理学信息,在个人或群体的水平上,关于外源性化学物引发的分子起始事件(MIE)和有害结局之间相互联系的框架。可以通过这个框架将分子起始事件引起损害作用的毒性试验结果外推到人,为收集和评估相关化学、生物学和毒理学信息提供框架,在毒理学风险评估中发挥重要作用。本文对AOP的概念及其框架的建立和评定进行了论述,并列举了已经在毒理学研究中建立的AOP框架的实例,以及其在毒理学应用方面的展望和挑战。
关键词 :危险性评估;毒理学;分子生物学;有害结局路径;关键事件
Development and application of adverse outcome pathway in toxicology research
WangYanhua,DuanHuawei     
Key Lab of Chemical Safety and Health, National Institute of Occupational Health and Poison Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China
Corresponding author: Duan Huawei, Email: huaweiduan@126.com
Abstract:Adverse outcome pathway (AOP) was a conceptual construct that integrated existing knowledge concerning the pathway of causal linkages between a molecular initiating event (MIE) and a final adverse effect at individual or population levels. The AOP methodology could be used as a basis for effects extrapolation and was an approach towards providing a framework for collecting and evaluating relevant chemical, biological and toxicological information. The framework would play an important role in risk assessment. We reviewed the concept of AOP, the development and assessment of the framework and the established models in toxicology researches. And the prospects and challenges of its application in toxicology were also introduced.
Key words :Risk assessment;Toxicology;Molecular biology;Adverse outcome pathway;Key event
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历年来,为了保护人类和环境免受化学品的危害,科学研究主要集中在单一化学物质的毒性测试领域。由于时间和成本的制约,详尽测试所有化学物质对人类和生态系统的影响是不切实际的,因此,有必要建立基于少量数据预测损害作用的模型。目前,由于对生物系统了解的局限性,我们不能仅仅通过现有信息外推化学物质引起生物损害的作用机制。毒理基因组学、生物信息学、系统生物学和计算毒理学近年来发展比较迅速[1],基于这些新的学科,科学家们准备在毒性测试和风险评估方面提出一种新的模式。
        许多研究机构采用系统方法和基于路径的方法来描述公共卫生相关毒物对人体产生损害作用的过程。早期关于路径的方法通常参考暴露-剂量-反应模型或生物剂量反应模型[2,3]。2001年,国际化学品安全方案(TOCS)用毒作用模式(mode of action,MOA)框架来确定动物数据与人类的相关性[4]。2007年,《科学》杂志(science)发表了"21世纪毒性测试报告:'毒性通路'概念的愿景和战略" [5]。该报告阐述了毒性测试策略变革的必要性、可行性及其发展前景。随着TOCS对MOA框架的细化,另一个概念––有害结局路径(adverse outcome pathway, AOP)也受到越来越多的关注,国内也有人译作有害结局通路[6]。AOP不是主张一个全新的模式,而是将现有的方法与系统生物学联系起来,为收集和评估相关化学、生物学和毒理学信息提供一个框架。2010年在美国佩尔斯顿举行的社会环境毒理学和化学会议上就对其进行了专门的探讨,研讨会的结果于2011年被发表在6篇文献中[7,8,9,10,11,12]。为评定人群和生态危险,经济合作发展组织(OECD)于2013年制定了AOP的指南[13]。作为毒理学测试分析的新策略,2014年欧洲毒理学大会将AOP作为专题进行了讨论,国内以军事医学科学院为代表的研究机构也就该策略和框架进行了推广。本文就新发表的OECD框架和几次学术交流中对该策略的了解,对AOP的概念及其框架的建立和评定进行了综述,并列举了已经在毒理学研究中建立的AOP框架的实例,以及其在毒理学应用方面的展望和挑战。

一、概述  相关术语关系以及AOP简介:毒性通路是指细胞的反应通路,当其紊乱到一定程度时会导致机体的损害作用,一般包括从细胞膜受体结合到基因表达的一系列分子事件,甚至包括细胞层面的反应,如细胞增殖或凋亡[14]。MOA是指以化学物与生物分子交互作用开始的,证据权重支持的,可能导致毒性有关终点的一组事件。
        毒性通路、MOA和AOP有内在的一致性,都强调毒作用机制的研究,但在理念上又有所不同。如图1所示,AOP在毒性通路和作用模式基础上进一步扩展,更突出了暴露至群体中发生有害效应的关键环节的分析,是在个体或群体的水平上,关于分子起始事件(molecular initiating event,MIE)和有害结局之间联系的框架。因此,AOP是跨越多个层次的生物组织,它可以描述一个以非特异性相互作用为起始的路径,也可描述特异性配体-受体相互作用导致的损害作用[15]

图1毒性通路、作用模式、有害结局路径、从源到结局路径概念的理论范围[13]
生物不同组织结构层次之间的关系可以基于机制、推理及其相关性,相关信息可来源于体外、体内或计算机系统[16]。AOP是从MIE到产生有害结局的相关生物反应的一系列有序发展过程(图2)。
图2有害结局路径相关生物反应过程[13]

二、AOP的建立  

1.识别损害作用:  因暴露持续时间、性别、物种的不同可产生不同层次的损害作用。最终的损害作用是个体或群体水平上AOP的一个特殊锚位,如细胞增殖、分化等,能很好的评估细胞或组织水平的损害作用。损害作用可分为:(1)长期健康终点,其作用是多个事件的结果,如重复剂量毒性;(2)局部作用,如皮肤过敏,皮肤和眼刺激[6]

2.确定MIE:  MIE由外源化学物引起,是生物分子和生物系统最初始的反应,通过毒性通路引起某一结局,不同的MIE可以导致相同的AOP。MIE中化学物质对生物系统的作用一般发生在分子水平上,大多化学物可以与多种靶分子相互作用。MIE是AOP的另一主要锚位,对识别导致最终损害作用的一系列反应至关重要。MIE中化学物或其代谢产物与蛋白质和(或)DNA发生共价结合,而与受体或酶的结合通常是基于非共价作用,更具有选择性。在理想情况下,识别MIE不仅有助于发现化学物质的潜在危害,而且可标记作用位点。例如,皮肤过敏和肝纤维化可能都发生亲电子物质的代谢转换,但是作用位点不同。

3.识别导致损害作用的关键事件:  关键事件是存在于MIE和最终损害作用之间的中间事件的集合。中间事件可能很多,但邻近事件之间的关系通常是可以被识别的。关键事件是MOA中不可或缺、可检测的前体步骤或者生物标志。AOP的中间事件发生于体内事件,且这些体内事件会对生物体造成损害作用。体内、外信息及高通量筛选(HTS)组学方法,甚至计算机方法,都可以为建立和评价AOP提供资料。当一个关键事件存在于多个AOP中时,AOP之间可以共享信息。

三、AOP的评定  AOP评定过程中重要的是对其可靠性和稳健性进行评价,注重对AOP的定性认识和定量认识。无论是定性还是定量认识的评定,都需要明确描述评定的关键步骤和科学证据的可靠性。AOP评定的第一个阶段是通过数据总结对每一个关键的步骤进行科学的论证和评价。最常见的AOP报告是通过一个流程图将不同的AOP信息模块有序的呈现出来[17]。另一阶段是利用希尔标准(Hill Criteria)评定AOP因果关系的权重。希尔标准在MOA或人类相关性分析的案例研究中已经被引用[18,19,20]。在评估中要求明确以下准则[13]:(1)剂量-反应关系的一致性;(2)关键事件和有害作用间时序的一致性;(3)有害作用与起始事件关联的强度、可重复性和特异性;(4)生物学合理性、连贯性和实验证据的一致性;(5)逻辑上反映自身的替代机制,便于在一定程度上能够从假定的AOP中分离出来;(6)不确定性、不一致性和数据缺口。

四、AOP的可信度  AOP框架的最后一步是可信度的说明,即回答OECD提出的关键问题[13]:(1)是否很好的表征MIE?(2)是否很好的表征最终的结局?(3) MIE和其他关键事件与结局的因果联系如何?(4)支持AOP的证据有无缺口?(5) AOP对机体的某些组织、生命阶段或年龄段是否有特异性?(6)在物种间MIE和其他关键事件的保守程度如何?

五、AOP框架举例  

1.皮肤过敏的AOP框架:  过敏性皮炎是由可引起皮肤过敏的小分子活性化学物引起的一种超敏反应。包含2个主要阶段:致敏阶段,即初次接触化学物并产生免疫记忆;激发阶段,随后接触相同化学物后产生明显的临床症状[21]。致敏阶段始于化学物渗透皮肤的外表皮层,通常与生物转化过程相关。随后化学物或其代谢产物与皮肤蛋白共价作用,称为半抗原化。半抗原化学物触发角质细胞炎性反应,引起促炎白细胞介素1β的表达。树突细胞中也可观察到类似炎性反应,如郎格尔罕斯细胞被激活。活化的树突细胞迁移至局部淋巴结,将部分半抗原化学物转至幼稚T淋巴细胞,最终导致记忆T细胞的增殖和分化[22,23]
        再次接触化学物时进入激发阶段。随着皮肤渗透和半抗原化,半抗原化学物进入树突细胞,这使之前存在的记忆T细胞循环到达上皮,分泌促炎性细胞因子,调动T淋巴细胞。最终导致与皮肤炎症相关的典型临床症状,如红色皮疹、水泡和皮肤瘙痒等[23]
        OECD基于包含致敏阶段和激发阶段的特色通路为化学物导致的皮肤过敏建立了AOP[13]图3)。在该AOP框架例证中也标记了毒性通路、MOA和AOP的研究范围,以便于区分这几个毒理学概念的范畴。

图3皮肤过敏反应有害结局路径框架[13]
其中,MIE包括化学物与蛋白质的共价作用。随着皮肤渗透,最终导致与局部炎症反应相关的有害结局。除了以上2个锚位,还识别了分子水平和器官水平的3个关键事件,即角质细胞的炎性反应、树突细胞的活化和T淋巴细胞的增殖。此AOP框架已经通过希尔标准和OECD提出的关键问题的论证,进行了证据权重和可信度的评估。

2.肝纤维化的AOP框架:  肝纤维化是急性或慢性肝细胞损伤过程中的可逆性愈合反应,反映了肝修复和瘢痕形成间的平衡。肝纤维化的中心环节是肝星状细胞(hepaticstellate cell,HSC)的活化,分为2个阶段:启动阶段和持续阶段[24]。启动阶段主要指HSC基因表达和表型的早期变化,使其对细胞因子和刺激具有反应性;持续阶段指激活状态的维持及纤维化的过程,HSC可能发生与增殖、收缩、纤维化、增生、趋化性、细胞外基质降解和维生素A缺失等有关的变化,并生成纤维细胞样表型[25]
        肝纤维化形成的另一个重要原因是细胞外基质(Extracellular Matrixc,ECM)的过度沉积。肝纤维化的肝脏含胶原量是正常肝脏的6倍。细胞因子有促进胶原酶合成和增强其活性的作用,从而使ECM生成增多,参与肝纤维化过程[26]
        2012年欧洲委员会联合研究中心提出了描述化学诱导肝纤维化的AOP[26]图4)。MIE是蛋白质烷基化;明显的有害结局是器官水平的肝纤维化;中间事件包括:肝细胞损伤和细胞凋亡、枯否细胞活化、转化因子β1表达、HSC活化、氧化应激和慢性炎症反应、胶原纤维积聚和肝ECM成分改变。该AOP框架已经进行了证据权重的主观评估,包含MIE、中间事件和有害结局。

图4肝纤维化有害结局路径框架[26]

六、展望和挑战  在毒理学危险度评估中,人群数据资料比动物实验数据更具优先性,但由于缺乏适当人群反应的数据信息,所以目前必须依赖于动物实验数据[27]。随着AOP的发展,在理想状况下,可不依赖动物实验进行毒性预测和人类危害评价,尤其是在化妆品领域[28]。但在相当一段时间内,体外细胞实验依旧无法替代整体动物实验。
        在危害评定中,为了实施预测策略,需要将MIE引起细胞反应的体外毒性试验结果外推到人。可以通过AOP将MIE与损害作用联系起来。AOP为评价毒作用机制提供框架,并且可推荐进一步研究的重点。AOP除了可用于定量风险评估[29],还可应用于以下3个方面:(1)实验操作的技术规范和技术标准,减少实验操作的差异;(2)确定跨物种的毒性通路,阐述有害生物效应和确定易感群体;(3)帮助外推作用效应。
        在AOP框架下整合从生物不同结构层次所获得的数据与知识,有助于毒理机制研究和危险评估。然而,除了OECD指导文件对AOP的建立和评估的介绍外,AOP的发展还处于初期阶段,仍存在局限性,在未来不断的调整中也将面临许多挑战[26]。比如,如何遵守毒理学过程的整体复杂性;如何量化剂量-反应关系;如何实现暴露数据和毒物动力学数据;如何全面评定MIE;如何建立一个透明的、客观的评价体系,包括实验操作的技术规范和技术标准等。

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