中华预防医学杂志    2014年06期 2010–2012年广州市柯萨奇病毒A4、A10型VP1基因特征分析    PDF     文章点击量:2119    
中华预防医学杂志2014年06期
中华医学会主办。
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甄若楠 张颖 谢华萍 陈纯 耿进妹 和鹏 狄飚 王鸣
2010–2012年广州市柯萨奇病毒A4、A10型VP1基因特征分析
中华预防医学杂志, 2014,48(6)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.005
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2010–2012年广州市柯萨奇病毒A4、A10型VP1基因特征分析
甄若楠 张颖 谢华萍 陈纯 耿进妹 和鹏 狄飚 王鸣     
摘要: 目的

检测广州市2010–2012年手足口病(HFMD)病例粪便样本中的肠道病毒,并对其中的柯萨奇病毒A4型(CoxA4)和柯萨奇病毒A10型(CoxA10)VP1基因核苷酸序列进行进化分析。

方法

收集2010–2012年广州市HFMD疑似病例粪便样本5 484份,采用RT–PCR进行肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CoxA16)、CoxA4、CoxA10和其他肠道病毒阳性检测,阳性样本共4 111份。对其中的CoxA4及CoxA10阳性样本分别进行巢式RT–PCR,扩增肠道病毒VP1基因片段,并对VP1基因片段进行测序,利用生物信息学分析序列,构建系统进化树,进行进化分析。

结果

在4 111份肠道病毒阳性样本中,EV71、CoxA16、CoxA10、CoxA4的阳性率分别为35.1%(1 443/4 111)、30.7%(1 261/4 111)、2.0%(82/4 111)、0.8%(31/4 111),不同肠道病毒阳性率差异有统计学意义(χ2=148.34,P<0.05)。CoxA4样本以3岁组阳性率最高,为1.3%(7/534),CoxA10样本以0岁组阳性率最高,为3.7%(34/914);CoxA4样本阳性率4月份达到高峰,为2.6%(12/460),CoxA10样本阳性率8月份达到高峰,为4.3%(12/278)。VP1基因核苷酸遗传进化分析显示,CoxA4阳性样本VP1基因核苷酸序列可分为A、B 2个亚型,Cox A10阳性样本VP1基因核苷酸序列可分为A、B、C 3个亚型,广州市2010–2012年CoxA4和CoxA10阳性样本VP1基因核苷酸序列均属于A亚型。

结论

广州市2010–2012年HFMD病例粪便样本中CoxA4和CoxA10阳性样本VP1基因核苷酸序列均属于A亚型。

关键词 :手足口病;逆转录聚合酶链反应;柯萨奇病毒感染;肠道病毒A型,人
    
Abstract:Objective

To identify the enterovirus from stool samples of patients with hand, foot and mouth disease (HFMD) in Guangzhou from 2010 to 2012 and to perform phylogenetic analysis of the VP1 gene sequences of coxsackievirus A4 and coxsackievirus A10.

Methods

A total of 5 484 samples of suspected cases of HFMD which Guangzhou Center for Disease Control received from 2010 to 2012 were collected. Virus RNA was tested by nested RT-PCR method as human enterovirus 71, coxsackievirus A16, coxsackievirus A4, coxsackievirus A10 and other enteroviruses positive, and 4 111 samples were positive. Phylogenetic tree was constructed by partial VP1 gene sequences of coxsackievirus A4 and coxsackievirus A10 to perform phylogenetic analysis.

Results

In 4 111 enterovirus-positive samples, the positive rate of EV71, CoxA16, CoxA10 and CoxA4 was 35.1% (1 443/4 111), 30.7% (1 261/4 111), 2.0% (82/4 111), 0.8% (31/4 111) respectively. Different enterovirus-positive rate was statistically significant (χ2=148.34, P<0.05). Incidences of coxsackievirus A4 positive was highest in 3-year old children as 1.3% (7/534), and that of coxsackievirus A10 positive was highest in 0-year old children as 3.7% (34/914). The highest positive rate of diagnosed coxsackievirus A4 positive cases was admitted in April (2.6%, 12/460), and the highest positive rate of diagnosed coxsackievirus A10 positive cases was admitted in August 4.3% (12/278). Phylogenetic analysis indicated that all the CoxA4 stains were divided into subtype A and subtype B, and the CoxA10 stains were divided into subtypes A, subtype B and subtype C. The VP1 gene nucleotide sequences of CoxA4 and CoxA10 this study measured both belonged to subtype A.

Conclusions

The VP1 gene nucleotide sequences of CoxA4 and CoxA10 in Guangzhou from 2010 to 2012 both belonged to subtype A.

Key words :Hand,foot and mouth disease;Reverse transcriptase polymerase chain reaction;Coxsackievirus infections;Enterovirus A,human
全文

手足口病(hand–foot–mouth disease,HFMD)是世界范围流行的儿童常见传染病,由多种人类肠道病毒(human enterovirus,HEV)引起,是《中华人民共和国传染病防治法》规定的丙类传染病。可引起HFMD的病原体有20多种,主要为小RNA病毒科的肠道病毒[1]。据生物学和遗传特性,可将肠道病毒分为4个组(species):肠道病毒A、B、C、D组(EV–A、EV–B、EV–C、EV–D)。A组中大部分血清型和B组的部分血清型病毒与HFMD发病有关,其中以人肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CoxA16)最为常见。近年来,由于引起HFMD的病原谱发生变化,非EV71和非CoxA16阳性的其他肠道病毒阳性比例逐渐增大,EV71和CoxA16的比例有所下降[2],柯萨奇病毒A10型(coxsackievirus A10, CoxA10)逐渐引起人们的关注,近年来CoxA10感染的HFMD暴发事件在法国和芬兰等国家和地区不断被报道[3,4],可见引起HFMD的其他肠道病毒正受到越来越多的关注。

目前国内外对CoxA4和CoxA10的研究较少,并且主要局限于病毒的分离和型别鉴定上。为了解广州市CoxA4和CoxA10样本基因特征,笔者对广州市2010–2012年的HFMD病例粪便样本进行了检测,并对其中的CoxA4和CoxA10阳性样本的VP1基因核苷酸序列信息进行了分析。

材料与方法1.样本来源:

收集2010年1月至2012年12月由广州市CDC接收的HFMD病例粪便样本,共计5 484份,实验室诊断肠道病毒阳性4 111份,阳性率为75.0%。样本采集根据《广州市手足口病监测方案》要求进行。

2.核酸提取:

取1~2 g粪便样本,加入10 ml生理盐水稀释后,涡旋震荡1 min,4 ℃ 18 000×g离心10 min。取140 μl上清液,使用德国Qiagen公司的QLAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取病毒RNA,洗脱体积为50 μl,–80 ℃保存。

3.RT–PCR检测:

使用江苏硕士生物科技公司肠道病毒CoxA16型–EV71型–肠道病毒通用型核酸检测试剂盒对样本RNA进行检测。PCR反应体系:RT–PCR反应液7.5 μl,酶混合液5 μl,CoxA16型–EV71型–通用型三重反应液4 μl,模板8.5 μl。PCR反应条件:50 ℃ 30 min,95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,55 ℃ 40 s,45个循环。选取肠道病毒CoxA16型和EV71型结果均阴性,并且肠道病毒通用型阳性的样本,进一步使用易瑞生物科技有限公司的CoxA4荧光PCR试剂盒及CoxA10荧光PCR试剂盒进行检测。PCR反应体系:PCR反应液19.1 μl,逆转录酶0.5 μl,Taq酶0.4 μl,模板5 μl。PCR反应条件:45 ℃ 20 min,95 ℃ 10 s;95 ℃ 5 s,53 ℃ 60 s,45个循环。阳性判断标准:Ct值≤30时,样本判定为阳性;Ct值≥35时,判定为阴性;当30<Ct值<35时,重复实验1次,如仍在此范围,则按阳性处理。

4.RT–PCR扩增:

对荧光检测CoxA4及CoxA10阳性的样本分别进行巢式RT–PCR,扩增肠道病毒部分VP1基因片段。具体扩增引物及RT–PCR反应程序参见文献[5]。

5.VP1基因核苷酸序列测定与分析:

扩增产物送至上海英潍捷基公司,以测序引物AN232及AN233进行双向测序。测序结果采用DNAstar 5.0软件中的Seqman程序进行拼接组装成完整的基因序列。用DNAstar软件中的MegAlign软件对核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行同源性分析。使用ClustalX 2.0软件比对序列后,采用Mega 5.0软件构建进化树,用Kimura双校正模型和邻接法(neighbor–joining, NJ),建树的可靠性通过1 000 bp值评估。

6.统计学分析:

采用Epidata 3.1软件建立数据库,核查无误后录入SPSS 18.0软件进行统计学分析。对肠道病毒阳性率进行描述性分析,采用χ2检验进行不同肠道病毒阳性率差异的比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果1.病原学检测结果:

4 111份阳性样本中,男性阳性样本为2 281份,占55.5%,女性阳性样本为1 411份,占34.3%,其中有419份(10.2%)阳性样本性别未知。EV71阳性1 443份,占35.1%;CoxA16阳性1 261份,占30.7%;EV71和CoxA16均阳性83份,占2.0%;CoxA10阳性82份,占2.0%;CoxA4阳性31份,占0.8%;其他肠道病毒阳性1 211份,占29.4%。不同年份间不同肠道病毒阳性构成比差异有统计学意义(χ2=148.34,P<0.05)(表1)。

10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.005.T001

2010–2012年广州市手足口病病例粪便样本中肠道病毒检测结果[份(%)]

年份样本份数EV71阳性CoxA16阳性EV71和CoxA16均阳性CoxA10阳性CoxA4阳性其他肠道病毒阳性
20101 173529(45.1)227(19.4)21(1.8)27(2.3)10(0.9)359(30.5)
20111 206363(30.1)436(36.2)11(0.9)35(2.9)4(0.3)357(29.6)
20121 732551(31.8)598(34.5)51(2.9)20(1.2)17(1.0)495(28.6)
合计4 1111 443(35.1)1 261(30.7)83(2.0)82(2.0)31(0.8)1 211(29.4)

注:EV71:肠道病毒71型;CoxA16:柯萨奇病毒A16型;CoxA10:柯萨奇病毒A10型;CoxA4:柯萨奇病毒A4型

2.不同人口学特征HFMD病例病原检测:

CoxA4阳性样本中,男性阳性率为0.7%(16/2 281),女性为1.1%(15/1 411),差异无统计学意义(χ2=5.07,P=0.079);CoxA10阳性样本中,男性阳性率为2.3%(52/2 281),女性为2.1%(30/1 411),差异有统计学意义(χ2=9.60,P<0.05)。不同年龄组CoxA10阳性率差异有统计学意义,其中0岁组阳性率最高,为3.72%(34/914)。有351例HFMD病例年龄不详(表2)。

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2010–2012年广州市不同年龄组手足口病病例粪便样本中CoxA4和CoxA10阳性检测结果

年龄(岁)样本数(份)CoxA4阳性率[%(份)]CoxA10阳性率[%(份)]
09141.1(10)3.7(34)
18030.9(7)1.4(11)
21 1240.5(5)1.0(22)
35341.3(7)1.7(9)
41920.0(0)1.0(2)
≥51930.5(1)0.0(0)
未知3510.3(1)1.1(4)
合计4 1110.8(31)2.0(82)
χ27.8421.92
P>0.05<0.05

注:CoxA4:柯萨奇病毒A4型;CoxA10:柯萨奇病毒A10型

3.不同月份患HFMD病例的病原检测:

CoxA4阳性样本主要分布在4–7月,占96.8%(30/31),阳性率在4月份达到高峰,为2.6%。CoxA10阳性样本主要分布在4–10月,占97.6%(80/82),阳性率在8月份达到高峰,为4.3%(12/278)(表3)。

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2010–2012年广州市不同患病月份手足口病病例粪便样本CoxA4和CoxA10阳性检测结果

月份a样本数(份)CoxA4阳性率[%(份)]CoxA10阳性率[%(份)]
1260.0(0)0.0(0)
290.0(0)0.0(0)
3740.0(0)1.4(1)
44602.6(12)1.3(6)
57401.2(9)1.4(10)
67610.4(3)2.6(10)
76450.9(6)2.0(13)
82780.0(0)4.3(12)
92910.0(0)3.4(10)
103020.0(0)3.0(9)
113740.0(0)0.8(1)
121510.7(1)0.0(0)
合计4 1110.8(31)2.0(82)
χ235.1426.16
P<0.05<0.05

注:a月份为2010–2012年各月合计;CoxA4:柯萨奇病毒A4型;CoxA10:柯萨奇病毒A10型

4.VP1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析:

根据阳性样本所在月份及地区,按随机数字表法选取8份CoxA4阳性样本和12份CoxA10阳性样本,对其VP1基因的核苷酸和推导的氨基酸序列进行同源性分析。20份阳性样本VP1基因核苷酸序列的长度均为354 bp,编码118个氨基酸。8份CoxA4阳性样本VP1基因的核苷酸和推导的氨基酸序列均具有较高同源性,分别为95.3%~98.8%和97.4%~100.0%,与CoxA4原型株(High point)进行同源性比较,核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为84.3%~86.4%和93.9%~95.6%;12份CoxA10阳性样本VP1基因的核苷酸和推导的氨基酸序列同样具有较高同源性,为93.5%~100.0%和98.5%~100.0%,与CoxA10原型株(Kowalik)的核苷酸和氨基酸同源性分别为70.8%~74.4%和92.7%~94.1%。

5.VP1基因核苷酸进化分析:

分别对以上8份CoxA4阳性样本和12份CoxA10阳性样本的VP1基因核苷酸序列与原型株及GenBank已公布的国内外部分序列进行系统进化树分析,选用CoxA16型原型株G10(U05876)和EV71(U22521)为组外对照。结果显示,CoxA4阳性样本VP1基因核苷酸序列可分为A、B 2个亚型。本次研究测得序列均属于A亚型,同亚型间核苷酸和氨基酸同源性为93.5%~98.8%和97.4%~100.0%。CoxA10阳性样本VP1基因核苷酸序列可分为A、B、C 3个亚型,本次研究测得序列皆属于A亚型,Kowalik株独立成为C亚型,进化关系上与本次研究序列同为A亚型的核苷酸和氨基酸同源性为82.1%~99.5%和97.1%~100.0%(图1图2)。

10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.005.F0012010–2012年广州市柯萨奇病毒A4型VP1基因核苷酸系统进化树

●2010年广州市柯萨奇病毒A4型;■2011年广州市柯萨奇病毒A4型;▲2012年广州市柯萨奇病毒A4型

10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.005.F0022010–2012年广州市柯萨奇病毒A10型VP1基因核苷酸系统进化树

●2010年广州市柯萨奇病毒A10型;■2011年广州市柯萨奇病毒A10型;▲2012年广州市柯萨奇病毒A10型

讨论

外壳蛋白VP1基因的核苷酸序列具有基因多态性,且变异速率大,是病毒基因分型和遗传进化分析的重要靶点[6]。因此笔者选择VP1基因作为切入点,对CoxA4和CoxA10流行株进行基因特征和流行病学特征分析。

本次研究结果显示,CoxA4阳性样本主要分布于4–7月份,由于国内外关于CoxA4的研究较少,所以难以进行对比。CoxA10阳性率为2.0%,阳性样本主要分布于4–10月份,与国内外多个地区报告基本一致[3,7]。但张晓玲等[8]对上海地区分析发现,CoxA10在冬季达到高峰,尤其以12月份为最高,其中差异还需进一步探讨。本研究结果显示,CoxA10样本以0岁组阳性率最高,这可能与此年龄组儿童自身细胞及体液免疫机制尚未发育完善,体内血清抗体阳性率较低有关[9]。VP1序列同源性和进化分析结果表明,广州与国内其他地区,如云南(AB598054)、吉林(JQ715710)等的CoxA4毒株同处于A亚型。2004、2006年我国台湾2次出现CoxA4引起的暴发,2010年又出现与CoxA16的共循环[10],而国外未见该型的报道,推断中国CoxA4可能独立形成特有的A亚型,其在HFMD病原谱中的地位不容轻视。笔者对CoxA10的分型与Hu等[11]一致。本次研究测得的CoxA10阳性样本的VP1基因核苷酸序列,与中国其他地区[如台湾(JN896779)、河南(JX987441)、北京(JN169021)等]以及美国(AY919459)相同均属于A亚型,与芬兰(GU248493)、俄罗斯(JQ518455)等国家和地区属于不同亚型。有研究认为,中国CoxA10在进化关系上的独特谱系可能起源于日本和韩国[12]。国内CoxA10虽未出现暴发,但Lu等[7]研究表明,CoxA10可能是除EV71外另一种可单独引起HFMD重症的病原体。新加坡1项研究报道,CoxA10在引起HFMD的病原中与CoxA16和EV71具有同等重要性[13]

引起HFMD高发的主导毒株是多变、交替出现的。由于不存在交叉免疫,如果一种毒株通过自然感染建立的免疫屏障达到一定水平后,另一种毒株就会发挥主要作用,所以当EV71和CoxA16都达到一定的免疫保护水平后,其他肠道病毒很可能会成为HFMD的主导毒株[14]。提示加强CoxA4和CoxA10等其他肠道病毒的病原监测是必要的,有助于全面了解其遗传学信息及动态变化。由于多种病原体可能存在混合感染、全球范围持续的病毒迁移及缺乏有效的疫苗等原因,HFMD流行可能会持续较长时间[15],且肠道病毒间可能存在频繁的基因重组,对多种肠道病毒进行长期系统的监测及深入研究其生物学特性和分子流行病学特征具有十分重要的意义。

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