中华预防医学杂志    2014年06期 1961–2010年中国O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株ctxB和rstR基因变迁    PDF     文章点击量:1917    
中华预防医学杂志2014年06期
中华医学会主办。
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梁未丽 赵璇 张力 崔志刚 李杰 阚飙
1961–2010年中国O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株ctxB和rstR基因变迁
中华预防医学杂志, 2014,48(6)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.008
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1961–2010年中国O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株ctxB和rstR基因变迁
梁未丽 赵璇 张力 崔志刚 李杰 阚飙     
摘要: 目的

分析1961–2010年中国不同地区分离的O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株的ctxB变异特征和rstR基因类型。

方法

选取中国1961–2010年间分离的O1群霍乱弧菌菌株作为研究对象,共385株。应用PCR方法扩增ctxB基因并进行序列测定和分析;使用rstR型特异性引物扩增rstR基因,确定其基因型别。

结果

ctxB基因序列分析表明,385株被检菌株中52.5%(202/385)携带ctxBET,47.5%(183/385)携带ctxBclass,即第39位的酪氨酸(Y)变为组氨酸(H),68位的异亮氨酸(I)变为苏氨酸(T),呈现古典生物型菌株(O395)的序列特征。1961–1992年以携带ctxBET的菌株占绝对优势,比例高达98.4%(182/185);1993年后,携带ctxBclass的菌株增加,其中1993–2005年间携带ctxBclass菌株的比例达到97.2%(174/179);自2006年开始,重新出现了ctxBET为主导或二者共存的局面。rstR基因的检测表明约62.9%(242/385)的菌株携带rstRET,6.8% (26/385)的菌株携带rstRclass,其余菌株中存在不同的rstR组合形式,其中,以rstRETrstRclass的组合最多,占75.7%(75/99)。与ctxB相似,不同型别rstR的分布呈现时间特异性,1961–1992年期间以携带rstRET的菌株占主导(87%,161/185),1993年以后出现多态性变异,携带其他类型rstRrstRclassrstRenv及不同rstR组合的菌株明显增多,与rstRET共同存在。96%(25/26)、84%(63/75)和18/18的分别携带rstRclassrstRETrstRclass组合和rstRETrstRclassrstRenv组合的菌株均分离于1993年之后。

结论

中国霍乱弧菌菌株中ctxBrstR的型别分布有明显的时间特异性,rstR存在多种组合形式,反映了菌株多样性的遗传和进化特征。

关键词 :弧菌,霍乱,O1;基因型;遗传变异
    
Abstract:Objective

To understand the ctxB and rstR variations of toxigenic Vibrio cholerae (V.cholerae) O1 El Tor strains isolated from different provinces in China from 1961 to 2010.

Methods

All 385 toxigenic V.cholerae O1 El Tor strains were selected, which were isolated in China between year 1961 and 2010. ctxB gene was amplified by PCR method and sequenced for further analysis. rstR was detected with PCR by using the genotype specific primers.

Results

ctxB sequence analysis revealed that 52.5% (202/385) isolates carried ctxBET and 47.5% (183/385) carried ctxBclass, namely Y39 to H and I68 to T substitutions which were specific to the classical biotype CT-B sequence. From 1961 to 1992, strains carrying ctxBET were predominant and the proportion was as high as 98.4% (182/185). After 1993, strains carrying ctxBclass were sharply increased. Especially during year 1993 to year 2005, 97.2% (174/179) of the isolated strains carried ctxBclass. Since 2006, resurgence of dominant strains carrying ctxBET or co-existing of strains with ctxBET or ctxBclass was noticed. rstR genotype detection showed that 62.9% (242/385) of the tested strains carried the rstRET, while 6.8% (26/385) with rstRclass, and the remainings contained at least two types of rstR in different combination forms, among which rstRET+rstRclass combination were the most, accounting for 75.7% (75/99). Similar to the ctxB, the distribution of rstR genotypes showed time specificity. From 1961 to 1992, strains carrying rstRET predominated (87.0%, 161/185). After 1993, the diversity of rstR genotypes was observed accompanying by a sharp increase of strains containing other rstR genotype, such as rstRclass, rstRenv and different combinations. There were separately 96% (25/26), 84% (63/75) and 18/18 strains containing rstRclass, rstRET+rstRclass and rstRET+rstRclass+rstRenv isolated after 1993.

Conclusion

The distribution of different genotypes of ctxB and rstR showed obvious time-specificity, and there were various combining forms of rstR, reflecting the diversity of the genetic and evolutionary characteristics of Chinese V.cholerae isolates.

Key words :Vibrio cholerae O1;Genotype;Genetic variation
全文

霍乱毒素(cholera toxin,CT)是霍乱弧菌的重要毒力因子,由溶原性噬菌体CTXФ携带的ctxAB基因编码[1]。根据菌株血清群与生物型的不同和CTXФ基因组rstR/ig–2间隔区序列的差异[2],CTXФ可分为CTXclassФ,CTXETФ,CTXenvФ和CTXcalcФ,其rstR基因也被相应地区分为四型。通常古典生物型菌株携带CTXclass Ф,El Tor型菌株携带CTXETФ,此外,CT毒素B亚单位编码基因ctxB在两种生物型菌株中也存在异质性。随着第7次霍乱大流行在全球范围内的扩展,病原体出现了一系列的变化:El Tor生物型菌株出现了古典生物型的ctxB基因和表型特征[3,4,5]。自2002年首次报道在孟加拉国发现这种杂合型的El Tor菌株之后,在印度、莫桑比克、越南、泰国等地也有发现[4,6,7,8]。笔者选取了1961–2010年中国不同地区分离的385株O1群霍乱弧菌,PCR检测rstRctxB基因,分析其变迁,从而初步了解中国O1群El Tor型霍乱弧菌的变异特征和趋势。

材料与方法1.实验菌株:

从中国CDC传染病预防控制所的霍乱弧菌保藏菌库中选取中国1961–2010年间分离的O1群霍乱弧菌菌株作为研究对象,共385株。

2.试剂与仪器:

PCR扩增特异性引物由上海生工生物技术有限公司合成,PCR扩增的Taq DNA聚合酶及dNTP等相应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。PCR扩增仪为MJ PTC200(美国Bio–Rad公司),凝胶成像仪为Bio–Rad Gel Doc XR系统(美国Bio–Rad公司)。

3.菌株复苏:

将霍乱弧菌株从–80 ℃冰箱的甘油冻存管传出,接种于普通的LB琼脂培养基,37 ℃培养12~18 h,挑取若干菌落进行血清薄片凝集复核。

4.PCR模板制备:

挑取单个中等大小菌落至1.5 ml离心管中,加100 μl蒸馏水,煮沸7~8 min,冰浴5 min,离心取上清,–20 ℃冻存备用。

5.<italic>ctxB</italic>基因检测:

引物序列,上游序列为5′–GGTTGCTTCTCATCATC–3′,下游序列为5′–GAAAAA ACCCAAAGTCTA–3′。PCR反应体系:去离子水35.6 μl,10×PCR缓冲液5 μl,dNTP 4 μl,Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.4 μl,上下游引物(10 μmol/L)各2 μl,模板DNA 1 μl,总体积50 μl。PCR扩增参数:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,33个循环;72 ℃延伸7 min。

结果检测和序列分析:取4 μl PCR产物,与0.6 μl 6×溴酚蓝载样缓冲液混合后进行质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳,所用电压180~220 V,时间15~20 min,用凝胶成像仪读取结果。阳性产物送北京天一辉远生物科技有限公司进行双向测序,Mega 5.0对测序结果进行比对分析。

6.<italic>rstR</italic>基因检测:

引物参照文献[9],分别为针对CTXclassΦ,CTXETΦ和CTXenvΦ三种CTXΦ特异的rstR基因序列。PCR反应体系:去离子水21.3 μl,10×PCR缓冲液3 μl,dNTP 2.4 μl,Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.3 μl,上下游引物(10 μmol/L)各1 μl,模板DNA 1 μl,总体积30 μl。PCR扩增参数:(1)rstRETrstRclass:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 60 s,58 ℃ 60 s,72 ℃ 90 s,33个循环;72 ℃延伸7 min。(2)rstRenv:94 ℃预变性5 min,94 ℃ 45 s;55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,33个循环;72 ℃延伸7 min。

7.结果分析:

取4 μl PCR产物,与0.6 μl 6×溴酚蓝载样缓冲液混合后进行1%的琼脂糖凝胶电泳,所用电压180~220 V,时间15~20 min,用凝胶成像仪读取结果。

结果1.基本情况:

85株霍乱弧菌血清凝集全部为O1血清群,其中,环境分离株62株(包括水、海产品、苍蝇媒介来源等),患者分离株283株,其余40株来源不详。菌株分离的时间跨度为50年(1961–2010年),覆盖中国27个不同省份。

2.<italic>ctxB</italic>基因检测:

385株菌ctxB基因扩增均阳性,扩增产物大小为550 bp。对所有获得的ctxB序列信息用软件进行比对,结果显示,部分菌株的序列在两个位点上出现碱基的替换,导致CTB亚单位第39和68位的酪氨酸(Y)和异亮氨酸(I)分别突变为组氨酸(H)和苏氨酸(T),即出现古典生物型菌株(O395)的序列特征。有4株菌的ctxB仅在一个位点出现突变,仍归在El Tor型别中。其中,202株菌携带ctxBET,占菌株总数的52.5% (202/385),183株菌携带ctxBclass,占菌株总数的47.5%(183/385)。

1961–1992年的分离株共185株,其中182株均携带ctxBET,占1961–1992年检测菌株总数的98.4%。另外3株携带ctxBclass菌株分别于1961年分离于广东省,1963年分离于浙江省和1992年分离于重庆市。

1993–2010年间分离株共200株,其中,携带ctxBclass的菌株比例高达90.0%;仅20株携带ctxBET,分离年份分别为1993、1999、2000、2003、2006、2007、2008和2010年,见表1

10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.008.T001

各年份分离菌株ctxBETctxBclass基因型携带情况(株)

年份菌株数ctxBclassctxBET
196126125
1962909
1963514
1964707
1965202
1966101
1973606
1974404
1977707
1978707
197912012
198016016
1981707
1982909
1983505
198412012
1985909
1986707
1987707
1988404
1989505
1990505
1991606
1992716
1993752
199410100
199513130
1996660
1997770
199818180
199911101
200018171
200126260
2002770
2003321
200412120
200541410
2006101
2007606
20081147
2010321
合计385183202
3.<italic>rstR</italic>基因检测:

对385株霍乱弧菌进行3种不同CTXФ特异性的rstR基因检测,rstRETrstRclassrstRenv扩增产物大小分别为501、474、450 bp。在385株待检菌株中,发现有7种不同的rstR存在形式或组合,其中,6.8%的菌株(26株)仅携带rstRclass;62.9%的菌株(242株)仅携带rstRET;2株为仅携带rstRenv的菌株;19.5%的菌株(75株)同时携带rstRETrstRclass;3株菌携带rstRenvrstRclass;3株菌携带rstRETrstRenv;4.7%的菌株(18株)同时携带3种类型rstR;另有16株菌未检测出,占总数的4.4%,提示存在序列的变异。

rstR基因类型的分布有时间特异性,1961–1992年以携带rstRET的菌株占主导地位,1993年前后出现了携带不同类型rstR及组合菌株共存的局面,96%(25/26)、84%(63/75)和18/18的分别携带rstRclassrstRETrstRclass组合和rstRETrstRclassrstRenv组合的菌株均分离于1993年之后。185株分离于1961–1992年的菌株中,161株携带rstRET,占1961–1992年检测总数的87.0%;1株携带rstRclass的菌株,于1974年分离于新疆;12株同时携带rstRETrstRclass的菌株,分离于广东、上海、新疆、北京、安徽、云南;1株同时携带rstRETrstRenv的菌株,1992年分离于广东,剩余的10株菌rstR检测阴性。200株分离于1993–2010年的菌株中,25株携带rstRclass,占1993–2010年菌株数的12.5%;63株同时携带rstRETrstRclass,占同期菌株数的31.5%;81株为携带rstRET的菌株,占同期菌株数的40.5%;有18株菌同时携带rstRETrstRclassrstRenv3种类型的rstR,主要是2000年的11株广西分离株,其余来源于四川和江西等地。剩下的13株中有3株同时携带rstRclassrstRenv,2株仅携带rstRenv;另2株同时携带rstRETrstRenv,6株菌3种rstR均未检出,见表2

10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.008.T002

1961–2010年携带不同类型 rstR菌株的分布情况(株)

年份菌株数ECenvE+envC+envE+CE+C+env未扩出
196126220000202
1962990000000
1963540000001
1964770000000
1965210000100
1966110000000
1973630010101
1974411000002
1977750000002
1978770000000
197912120000000
198016160000000
1981770000000
1982960000300
1983550000000
198412120000000
1985980000100
1986770000000
1987760000001
1988440000000
1989550000000
1990530000101
1991650000100
1992750000200
1993730000400
19941060000301
19951331000900
1996600000600
1997721000400
19981850001741
19991131000700
200018110113110
200126311001722
2002711000401
2003300200100
20041209000210
200541360010301
2006110000000
2007630000300
200811110000000
2010330000000
合计38524226233751816

注:E表示rstRET;C表示rstRclass;env表示rstRenv

4.综合分析:

结合ctxBrstR基因型特征对检测菌株进行综合分析,1993年前的分离株,ctxBrstR的一致性高达85.4%(158/185),均为El Tor生物型菌株特异的基因型。1993年后,二者的一致性明显降低,出现古典生物型的特征和多种变异组合。ctxBrstR基因型特征在不同来源菌株中(如环境和患者分离株)及菌株地域分布上没有明显规律。

讨论

El Tor生物型霍乱弧菌毒素B亚单位呈现古典生物型特征的现象在孟加拉国、印度、莫桑比克等多地均有发现[4,6,7,8,9],在印度的加尔各答已完全取代原型El Tor菌株占据主导优势,同样的流行趋势也出现在孟加拉国和泰国。本次研究表明,中国El Tor生物型菌株中也出现了古典型ctxB。1961–1992年间携带ctxBET的菌株占绝对优势,1993–2005年则以携带ctxBclass菌株占主导。自2006开始,似乎又重新出现了ctxBET为主导或二者共存的局面,提示中国的霍乱弧菌菌株可能处于比较活跃的变异和交替阶段。

与国外报道不同的是,在中国携带ctxBclass的菌株没有完全取代携带ctxBET菌株,这可能是由于笔者挑选的菌株年代跨度较大,地区比较广泛,对于菌株的流行趋势呈现较好,也有可能是中国菌株本身的不同流行特点和趋势。另外,在1961年发现了最早的1株携带ctxBclass的El Tor型菌株,这将出现ctxBclass的El Tor型菌株的时间提前了近30年。国外的回顾性研究中,携带ctxBclass的El Tor型菌株出现在20世纪90年代初期[6,10]。笔者推测中国可能在1961年以及更早的时间就出现了携带ctxBclass的El Tor型霍乱菌株,只是在当时没有成为优势菌株。

古典生物型菌株和El Tor生物型菌株被认为是从不同的世系(lineage)进化而来。El Tor菌株具有更好的适应环境和宿主的能力,古典型菌株具有更强的毒力,前6次大流行均由其造成,El Tor菌株毒力基因上一些特定的结构使其造成的临床症状较古典型轻微,但持续时间更长[11]。CT毒素主要与霍乱的典型临床症状相关,El Tor型菌株中的古典型CT将如何影响该杂合菌型的致病性还不是很明确。Ghosh–Banerjee等[12]研究表明,携带ctxBclass的El Tor型变种霍乱弧菌与携带ctxBET的原型El Tor菌株相比,在兔肠断结扎实验中充血积液量增加了约20倍,与古典型霍乱弧菌在兔肠断结扎中的充血积液量相当,且El Tor型变种在兔肠段内的生长要好于古典型菌株。

为进一步了解CTXΦ基因簇在中国流行菌株中的分布和变化趋势,笔者通过PCR的方法检测了3种CTXΦ特异的rstR基因(rstRETrstRenvrstRclass)在中国菌株中存在情况。与国外研究相比,中国菌株中rstR的存在形式具有多样性,首次发现同时携带El Tor型,古典型和环境型3种类型rstR(rstRclassrstRenvrstRET)的菌株,并占有一定的比例。并且,在中国菌株中检出单纯携带rstRenv的产毒菌株,孟加拉国菌株中单纯rstRenv的检出率几乎为零,而是与rstRET组合存在[13]。在时间分布上,1961–1992年以携带El Tor型rstR的菌株占主导地位,1993年以后出现了携带不同类型rstR及组合菌株共存的局面。总体来说,仍以携带rstRET的菌株占优势,与国外报道相似。另外有18株检测的产毒株中未检测出任何一种上述的3种rstR,推测可能存在序列上的变异,提示有其他或新类型rstR的存在。出现多种CTXΦ的流行病学意义目前并不是很明确,在El Tor生物型菌株中出现rstRclass也更多地引起了学者们的思考,需进一步的研究。

参考文献
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