中华预防医学杂志    2014年06期 2008–2012年上海市急性弛缓性麻痹监测中非脊髓灰质炎肠道病毒的基因型分布    PDF     文章点击量:1736    
中华预防医学杂志2014年06期
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李云逸 陆菁 杨玉颖 丁晓光 刘敏勇 李崇山 孙晓冬
2008–2012年上海市急性弛缓性麻痹监测中非脊髓灰质炎肠道病毒的基因型分布
中华预防医学杂志, 2014,48(6)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.020
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2008–2012年上海市急性弛缓性麻痹监测中非脊髓灰质炎肠道病毒的基因型分布
李云逸 陆菁 杨玉颖 丁晓光 刘敏勇 李崇山 孙晓冬     
摘要:
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人类肠道病毒(human enterovirus,HEV)可以引起多种临床病症,如急性弛缓性麻痹(acute of laccid paralysis,AFP)、无菌性脑膜炎(aseptic menigitis, AM)、脑炎(encephalitis)、心肌炎(myocarditis)、急性出血性结膜炎、手足口病(hand foot and mouth disease, HFMD)及发热等类似感冒症状的综合病症。

目前HEV共有100多种基因型,分为5组,包括HEV-A、HEV-B、HEV-C、HEV-D组及脊髓灰质炎病毒(polioviruses,PV)。PV根据其序列同源性应属于HEV-C组,但由于其致病的特殊性被单独划分为一组[1]。笔者通过对2008–2012年上海市AFP监测系统中登记的15岁以下出现AFP症状的患者的粪便标本进行病毒分离,并对分离得到的非脊髓灰质炎肠道病毒(non-poliovirus enterovirus,NPEV)基因VP1编码区的核苷酸序列进行测定和分析,描述其基因分布及序列特征,现将结果报告如下。

一、材料与方法1.标本:

选取2008–2012年上海市AFP监测系统中登记的15岁以下出现AFP症状的患者双份粪便标本,共386例(770份,有两例病例只采集到单份标本),用于NPEV分离。

2.细胞:

人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosareoma,RD)和转人脊灰病毒受体的小鼠肺细胞系(mouse cell line expressing the gene for the human cellular rececptor for poliovirus,L20B)由中国CDC病毒病预防控制所提供。

3.试剂与仪器:

病毒RNA抽提试剂盒购自美国Applied Biosystems公司;RNA酶抑制剂试剂盒购于普洛麦格(北京)生物技术有限公司;One-step RT-PCR试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司。KINGFISHER FLEX自动核酸抽提仪购于美国Thermo公司;PCR仪购于美国Applied Biosystems公司;毛细管凝胶电泳仪购于德国QIAGEN公司。

4.病毒分离:

严格按照WHO制定的《脊髓灰质炎实验室手册》[2]处理所有粪便标本。取0.2 ml处理后的标本悬液分别接种到RD细胞和L20B细胞上,置于体积分数为5%的CO2培养箱中36 ℃条件下培养,连续观察细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况。判断标准:观察以上细胞至第2次传代(7 d/代),如无CPE,则再盲传2代,如仍未观察到CPE,则判断为病毒分离阴性。任何一种细胞如有CPE,则判断为病毒分离阳性,收获病毒冻存于–70 ℃备用。

5.毒株的选择:

2008–2012年上海市AFP监测中共分离到46株病毒阳性标本。如同一例患者的2份标本分离到相同的毒株,则视为1株病毒。其中PV阳性标本17株,经国家脊灰实验室(national poliovirus laboratory,NPL)鉴定,均为疫苗株。NPEV阳性标本29株,将29株标本进行分子生物学鉴定。

6.病毒RNA的提取:

取50 μl培养液采用美国Applied Biosystems公司的病毒RNA抽提试剂盒,按照说明书使用美国Thermo公司KINGFISHER FLEX自动核酸提取仪提取病毒RNA,提取的29份RNA溶解于50 μl的无菌无RNA酶水中,加入2 μl RNA酶抑制剂,储存于–20 ℃备用。

7.RT-PCR:

每份RNA样本均采用008~013、012~011引物[3]来进行分离株的分子生物学鉴定,引物序列见表1。使用One-step RT-PCR试剂盒对标本进行VP1编码区的核苷酸序列扩增。PCR产物用QIAxcel Advanced毛细管凝胶电泳仪进行电泳。阳性PCR产物送上海铂尚生物技术有限公司进行序列测定。

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肠道病毒逆转录聚合酶链反应的扩增引物

引物名称序列(5′-3′)位置特异性
008GCRTGCAATGAYTTCTCWGTVP3HEV
013GGIGCRTTICCYTCIGTCCAVP1HEV
011GCICCIGAYTGITGICCRAA2AHEV
012ATGTAYGTICCICCIGGIGGVP1HEV
486TGGTAICARACIAAITWYGTIGTNCCVP3HEV-A
487ATGTWYGYICCICCIGGIGCNCCVP1HEV-A
488GTIGGRTAICCITCITARAACCAYTGVP1HEV-A
489AYIGCICCISWITGYTGNCC2AHEV-A
490TGIGTIYTITGYRTICCITGGATVP3HEV-B
491ATGTAYRTICCICCIGGNGGVP1HEV-B
492GGRTTIGTIGWYTGCCAVP1HEV-B
493TCNACIANICCIGGICCYTC2AHEV-B
494GAYGAYWSITTIACIGAIGGNGGVP3HEV-C
495ATGTAYRTICCICCIGGIGCNCCVP1HEV-C
496CCRTCITARAARTGISIRTANGCVP1HEV-C
497GCITTITTITGRTGICCRAANCC2AHEV-C

注:HEV:人类肠道病毒;HEV-A、HEV-B、HEV-C分别为人类肠道病毒A、B、C组;VP1、VP2、VP3、2A分别表示前体蛋白的不同编码区

若无法得到VP1完整编码序列的样本,再分别采用HEV-A、HEV-B、HEV-C组病毒特异性引物[4]进行VP1完整编码区的核苷酸序列扩增,引物序列见表1。PCR产物用QIAxcel Advanced毛细管凝胶电泳仪进行电泳。阳性PCR产物送上海铂尚生物技术有限公司进行序列测定。

8.序列测定与分析:

(1)分子生物学鉴定:29株NPEV中共有24株获得了完整VP1编码区序列,采用Sequencher 4.0.5软件(对测序结果进行校对处理,确定其基因分型)。基因分型的标准[5]:将24株NPEV的有效序列与Genbank中相应的基因型进行比较,若VP1编码区核苷酸同源性≥75%或氨基酸同源性≥88%,判断为同一个血清型;同一血清型不同分离株之间VP1编码区核苷酸差异>15%,则被划分为不同的基因型。(2)同源性分析:由于EV88型毒株为中国首次发现的一种新型EV,EV71型毒株为HFMD的主要病原体之一,故采用Bioedit软件(Version7.0.0)分别对EV88和EV71型毒株的VP1编码区的核苷酸序列进行同源性分析,采用Mega(Version4.0.2)软件,使用邻接法(neighbor-joining method)构建系统发生树。

二、结果1.基因型分布:

2008–2012年AFP病例中分离出29株NPEV,获得完整VP1编码区序列24株(表2)。其中HEV-A组共有7株,基因定型结果属于2个基因型,CVA4和EV71型;HEV-B组共有17株,基因定型结果属于11个基因型,分别为CVB1、CVB2、E2、E3、E6、E7、E11、E13、E15、E24、EV88型。5株无法获得完整VP1编码区序列。

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上海市2008–2012年肠道病毒的分布情况

基因型2008年2009年2010年2011年2012年合计
HEV-A组
CVA4101024
EV71111003
HEV-B组
CVB1000202
CVB2000112
ECHO2000101
ECHO3000101
ECHO6011002
ECHO7101002
ECHO11010023
ECHO13001001
ECHO15010001
ECHO24000101
EV88000011
其他a111025
合计4568629

注:HEV:人类肠道病毒。a表示没有获得完整VP1编码区序列的毒株,不能确定其基因分型

2.EV88型毒株的同源性分析:

搜索GenBank核苷酸数据库中只有2条完整的EV88型毒株的VP1编码区序列。分别为原型株BAN01-10398(简称原型株,GenBank号:AY843306)[6]和印度株N-206(简称印度株,GenBank号:JN204092)[7]。将其与本研究分离到的EV88型毒株,即上海株12127进行同源性分析,结果显示,3种毒株的VP1编码区核苷酸序列长度均为876个核苷酸,编码292个氨基酸,其中,上海株12127与原型株和印度株核苷酸同源性分别为82.1%和82.3%,氨基酸同源性为94.1%~94.5%。而原型株与印度株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为83.1%和94.5%。

3.EV71型毒株的同源性分析:

2008–2010年AFP病例标本中分离到3株EV71型毒株。将3株EV71型毒株的VP1编码区基因核苷酸序列进行核苷酸同源性分析,并构建亲缘性关系树。所有核苷酸序列的长度均为891个核苷酸,编码297个氨基酸。3株EV71分离株在C4基因亚型ClusterⅥ分支上,其核苷酸同源性为98.7%~100%,氨基酸同源性为98.6%~100%。3株EV71分离株与上海其他来源的EV71分离株都属于C4基因亚型,核苷酸同源性为93.9%~99.2%,氨基酸同源性为97.6%~99.6%;与A型代表株EV71BrCr的核苷酸和氨基酸同源性分别为81.8%和93.9%~94.2%;与B基因型代表株1413-CA-87的核苷酸和氨基酸同源性分别为83.5%~84.0%和95.6%~96.6%;与C1、C2、C3、C5基因亚型代表株核苷酸序列同源性分别为88.4%~88.5%、89.5%、88.7%~88.8%、87.7%~88.0%,氨基酸同源性为98.3%、98.6%、98.6%、98.6%。具体见图1

10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.020.F001EV71分离株与各基因(亚)型参考株VP<sub>1</sub>编码区基因亲缘性系统进化树

○ 上海市2009年健康儿童标本分离株;■ 上海市2010年手足口标本分离株;● 上海市2008–2010年AFP标本分离株;□ 上海市2008年手足口标本分离株;▲ 上海市2002年分离株;HFMD:手足口病;AFP:急性弛缓性麻痹;EV71:肠道病毒71型;R2、R3、R4分别表示RD细胞第2代次、第3代次、第4代次,其前方数字表示标本编号;V2、V4分别表示VERO细胞第2代次、第4代次(其他来源分离的EV71曾用VERO细胞分离),其前方数字表示标本编号;SHH02表示上海2002年分离株;基因型A、B、C 分别表示EV71的基因型,其中C基因型又分为5个基因亚型分别为基因型C1、C2、C3、C4、C5;ClsuterⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分别表示C4亚型中的5个不同分支

三、讨论

2008–2012年上海市共从386例AFP患者粪便样本中分离出29株NPEV,在获得完整VP1编码区序列的24株病毒中,7株属HEV-A组,17株属HEV-B组。

HEV-A包括柯萨奇病毒( Coxsackievirus, CV) A2~A8、A10、A12、A14、1A6、EV71、EV76、EV89~EV92型,可以引起HFMD等疾病[8]。而近些年HFMD在中国多个地区出现大规模的暴发流行,主要的型别为EV71型和柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus group A type 16,CA16)[9,10,11]。本研究中AFP患者粪便标本中分离到的3株EV71型毒株与上海其他来源的EV71型毒株均属于C4基因亚型。2008–2012年以后分离的EV71型毒株(包括AFP和其他来源的EV71)分别属于Cluster Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ分支;而2002年分离的EV71型毒株分别属于Cluster Ⅰ、Ⅱ分支。虽然同样属于C4基因亚型,但2002年分离的毒株与2008年以后分离的毒株已经发生了较大的变异,变异毒株已经成为导致HFMD流行的优势毒株。但在同一个Cluster Ⅵ分支中也有很多小的分支,这表明了2008–2010年之间有不同传播链的存在。

HEV-B组是血清型最多的一组EV,也可引起多种疾病。AM的暴发也多由HEV-B组中的CVB5、ECHO6、ECHO11、ECHO13、ECHO30型毒株等引起。本研究中也分离到2株ECHO6、3株ECHO11、1株ECHO13型毒株。而且,本研究在中国首次发现了1株新型EV,即EV88型毒株,属于HEV-B组,通过GenBank核苷酸数据库搜索该基因型,只发现2株分离株,分别为孟加拉国原型株BAN01-10398型和印度株JN204092型。国内尚无该分离株的报道,提示该基因型在世界范围内流行强度非常小。序列分析显示上海株与原型株和印度株核苷酸同源性只有82.1%和82.3%。原型株与印度株之间的核苷酸同源性也只有83.1%。说明这3株EV88核苷酸差异较大,显示较远的亲缘关系。另外,EV88型上海株分离自AFP患者粪便标本,因此该分离株是否为AFP的相关病因还尚不清楚。

参考文献
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