中华预防医学杂志    2014年09期 乳腺癌细胞系HCC1937和MCF7在DNA损伤修复反应时功能的比较    PDF     文章点击量:3202    
中华预防医学杂志2014年09期
中华医学会主办。
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董超 张凤梅 赵锡鹏 郭公社 罗月 凤志慧
DongChao,ZhangFengmei,ZhaoXipeng,GuoGongshe,LuoYue,FengZhihui
乳腺癌细胞系HCC1937和MCF7在DNA损伤修复反应时功能的比较
Comparative study on functional characters of MCF7 and HCC1937 cell lines in response to DNA damage
中华预防医学杂志, 2014,48(9)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.09.013
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投稿日期: 2014-02-28
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乳腺癌细胞系HCC1937和MCF7在DNA损伤修复反应时功能的比较
董超 张凤梅 赵锡鹏 郭公社 罗月 凤志慧     
董超 250012 济南,山东大学公共卫生学院环境健康系
张凤梅 250012 济南,山东大学公共卫生学院环境健康系
赵锡鹏 250012 济南,山东大学公共卫生学院环境健康系
郭公社 250012 济南,山东大学公共卫生学院环境健康系
罗月 250012 济南,山东大学公共卫生学院环境健康系
凤志慧 250012 济南,山东大学公共卫生学院环境健康系
摘要: 目的  通过比较DNA损伤修复基因乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)和抑癌基因p53在HCC1937和MCF7两种乳腺癌细胞系中的功能状态及对DNA损伤修复反应的应答特性,研究两种细胞系在功能上的差异。方法  应用western-blotting法检测两种乳腺癌细胞系中BRCA1和p53蛋白的表达,并检测了经过10 Gy电离辐射下1、4、8 h后BRCA1蛋白在MCF7、HCC1937和HCC1937野生型BRCA1(HCC1937 wtBRCA1)细胞系中的表达水平。同时用免疫荧光法观察BRCA1蛋白在MCF7和HCC1937细胞系细胞内的分布和焦点形成情况,并对电离辐射下的BRCA1、Rad51蛋白的焦点形成百分比进行计算。进一步用流式细胞仪检测两种细胞系的细胞周期变化。结果  MCF7细胞中野生型的BRCA1和p53主要分布于细胞核内,这两种蛋白对DNA损伤反应有应答。10 Gy 8 h照射条件下,MCF7细胞系中BRCA1蛋白焦点形成百分比较无电离辐射高[(59.40±3.66)%比(11.80±3.51)%,t=16.26,P<0.05];MCF7细胞系照射组中Rad51蛋白焦点形成百分比较无电离辐射高[(73.90±8.66)%比(16.70±3.76)%,t=10.49,P<0.05],照射组p53蛋白[(82.54±1.04)比(23.75±0.51),t=87.90,P<0.05]和p21蛋白[(90.95±1.13)比(50.19±0.89),t= 49.11,P<0.05]表达水平均较无电离辐射高,细胞在G1期蓄积。与MCF7细胞相比,在HCC1937细胞中的BRCA1和p53都产生了变异,在细胞核内两种蛋白较少。10 Gy 8 h照射条件下HCC1937细胞中无BRCA1蛋白焦点形成、p53和p21几乎无诱导表达以及细胞在G1和G2-M期无明显的蓄积。当恢复野生型BRCA1在HCC1937细胞内表达后,10 Gy 8 h照射条件下Rad51蛋白焦点形成百分比较无电离辐射高[(61.70±4.03)%比(6.22±2.27)%,t=20.78,P<0.05],细胞在G2-M期的蓄积增多。结论  乳腺癌细胞系HCC1937和MCF7在应答DNA损伤修复反应时具有不同的功能特性。
关键词 :乳腺肿瘤;BRCA1蛋白质;DNA损伤;HCC1937;MCF7
Comparative study on functional characters of MCF7 and HCC1937 cell lines in response to DNA damage
DongChao,ZhangFengmei,ZhaoXipeng,GuoGongshe,LuoYue,FengZhihui     
Department of Environment Health, Public Health School, Shandong University, Jinan 250012, China
Corresponding author: Feng Zhihui, Email: fengzhihui@sdu.edu.cn
Abstract:Objective  The functional characters of MCF7 and HCC1937 cell lines were compared through the activity of BRCA1 and p53 following DNA damage in order to provide more research evidence for the related studies in both breast cancer cell lines.Methods  The protein level of BRCA1 and p53 in two breast cancer cell lines and the protein level of BRCA1 in MCF7, HCC1937 and HCC1937 wtBRCA1 breast cancer cell lines treated with 10Gy after 1 h, 4 h or 8 h were detected by western blotting analysis. The distribution and foci formation of BRCA1 in the cells were observed through immunostaining assay and the percentage of BRCA1 or Rad51 foci formation after ionizing radiation was calculated. Cell cycle profiling was analyzed using flow cytometry.Results  Most of BRCA1 and p53 localized in nucleus, and both proteins responded to DNA damage in MCF7 cells. In MCF7 cells, BRCA1 and Rad51 foci formation respectively increased to (59.40±3.66)% from (11.80±3.51)% (t=16.26, P<0.05) and (73.90±8.66)% from (16.70±3.76)% (t=10.49, P<0.05) after 10 Gy 8 h ; p53 and p21 protein level was further separately induced and enhanced to (82.54±1.04) from (23.75±0.51) (t=87.90, P<0.05) and (90.95±1.13) from (50.19±0.89) ( t=49.11, P<0.05) after 10 Gy 8 h; and the cells were accumulated in G1 phase. In contrast to MCF7, in HCC1937 cell line, both of BRCA1 and p53 were defective in nucleus since both proteins were mutated; in response to DNA damage, BRCA1 foci formation was not found, p53 and p21 was not induced; there was no cell accumulation in both of G1-S and G2-M phases. However, after complementation of wild-type BRCA1 in HCC1937 cells, DNA damage-induced Rad51 foci formation increased to (61.70±4.03)% from (6.22±2.27)% (t=20.78, P<0.05) and accumulation of cells in G2-M phase was also restored after 10 Gy 8h, which was similar to that of in MCF7 cells.Conclusions  We have identified that BRCA1 and p53 have dramatically different functions in MCF7 and HCC1937 cell lines in response to DNA damage.
Key words :Breast neoplasms;BRCA1 protein;DNA damage;HCC1937;MCF7
全文

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。关于乳腺癌的发生、发展、预防和治疗等方面的研究日益受到人们的重视和关注。与乳腺癌研究相关的细胞系有41种,如MCF7、HCC1937、MDA-MB-436、SUM149PT、MDA-MB-453和SUM1315MO2等[1,2]。如何选择和应用正确的细胞系是在细胞和分子生物学水平上进行乳腺癌相关研究时的关键因素之一。笔者以乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)和p53两种关键的抑癌基因为研究指标,比较它们在MCF7和HCC1937两种常用乳腺癌细胞系中的表达、细胞内分布以及对DNA损伤修复反应的应答等方面特性,揭示这两种细胞系功能上的差异,为正确应用这两种细胞系进行乳腺癌相关研究提供重要的实验依据。

材料与方法  

1.材料:  MCF7和HCC1937细胞系,购自美国American Type Culture Collection公司;野生型BRCA1(wild type BRCA1,wtBRCA1)和空载体质粒由牛津大学Simon Powell博士馈赠。抗乳腺癌易感基因1 D9[BRCA1(D9)]、Rad51(H92)和p53(DO1)的抗体,购自美国Santa Cruz Technology公司;抗乳腺癌易感基因1 Ab-1[BRCA1(Ab-1)]、p53(Ab-7)、核孔蛋白(nuclear pore)的抗体,购自美国Calbiochem公司;抗p21的抗体,购自美国BD Pharmingen公司;抗β-肌动蛋白(β-actin)的抗体,购自美国Sigma公司;抗鼠二抗,购自美国Pierce公司;抗鼠、抗兔、抗羊荧光二抗,购自美国Invitrogen公司。

2.电离辐射(ionizing radiation,IR)条件:  6 mv X射线,吸收剂量率2.33 Gy/min,射野大小:40 cm×40 cm,Primus S型直线加速器(德国西门子公司)单次给予细胞10 Gy照射[3,4,5]

3.细胞培养:  MCF7被培养于含体积分数为10%牛血清(美国Hyclone公司)的DMEM培养基(美国Gibco公司),HCC1937被培养于含体积分数为15%牛血清的DMEM培养基,培养环境为37 ℃,体积分数为5%的CO2培养箱。HCC1937细胞用Lipofectamine 2000 (购自美国Invitrogen公司)转染wtBRCA1-pcDNA3和pcDNA3空载体质粒后,再用含300 μg/ml G418(购自美国Mediatech公司)体积分数为15%牛血清的DMEM培养基筛选出抗G418的单克隆细胞,建立分别稳定表达wtBRCA1和空载体的HCC1937野生型BRCA1和HCC1937空载体细胞系[3]

4.免疫印迹法检测蛋白含量及磷酸化水平:  分别将细胞接种于p60培养皿中,待细胞贴壁后IR处理细胞。继续培养6 h,收集细胞,用预冷的PBS洗3遍,1 000×g离心5 min后弃上清,再用50 mmol Tris-HCl,pH为7.4,150 mmol Nacl,1 mmol EDTA,体积分数为1%曲拉通X-100(Triton X-100)配制裂解液提取细胞总蛋白,经BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)定量后,将各样品蛋白浓度调至相同[6]。取80 μg总蛋白上样,经SPS-PAGE处理后将蛋白转移到聚偏氯乙烯(PVDF)膜上,用质量分数为6%脱脂奶粉室温封闭1 h,一抗4 ℃摇床过夜,过夜后用Tris缓冲盐水(TBS)洗涤3次,每次各5 min,加入用辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1 h后,TBS洗涤3次,每次各10 min,最后暗室显定影,观察结果。以β-actin为内参对照,采用ImageJ 1.48软件计算灰度值,作为其蛋白相对表达量。

5.免疫荧光染色:  细胞接种于4孔载玻片小室中,待细胞贴壁后对细胞进行10 Gy照射,IR处理后继续培养6 h,然后用体积分数为4%甲醛固定。用PBS冲洗3次,在盖玻片上滴加50 μl一抗稀释液,4 ℃静置1 h,用PBS冲洗3次,在盖玻片上滴加50 μl FITC标记二抗稀释液,37 ℃静置1 h,用PBS冲洗3次,最后1次冲洗时加入终浓度为100 ng/ml的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI),染色2 min,染色结束后用PBS冲洗2次,通过尼康ELIPSE Ti-U倒置生物显微镜(日本Nikon公司)进行观察。

6.细胞周期检测:  取指数生长期细胞接种于p60培养皿中,待细胞贴壁后IR处理细胞。继续培养24 h后,收集细胞,用预冷的PBS洗2遍,1 000×g离心5 min后弃上清,再加入体积分数为70%预冷冰乙醇固定过夜。固定后的细胞用核糖核酸酶A(RNase A,250 μg/ml,美国Sigma公司)、碘化丙碇(25 μg/ml,美国Sigma公司)以及0.1% Triton X-100配制的PI染色液室温下染色30 min,染色后的细胞通过流式细胞仪(美国BeckMan Coulter公司)检测细胞周期。

7.统计学分析:  采用SPSS 19.0统计软件进行分析,实验均重复3次,计量资料符合正态分布,用±s表示。BRCA1、p53蛋白表达灰度值、焦点形成百分比服从正态分布且方差齐,采用两独立样本比较t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

结果  

1.在未应答DNA损伤反应时,MCF7和HCC1937细胞系中BRCA1的功能特性比较:  western-blotting结果显示见表1,在MCF7及HCC1937 wtBRCA1细胞系,可识别BRCA1 N-末端的BRCA1(Ab-1)或C-末端的BRCA1(D9)的两种抗体均成功地检测到了BRCA1的蛋白表达,且两种细胞的BRCA1的表达带在位置和形状上基本一致。在HCC1937细胞系,应用BRCA1(Ab-1)抗体检测到较弱的BRCA1表达带,且位置下移;而应用BRCA1(D9)抗体未观察到该蛋白的表达。

表1BRCA1蛋白在MCF7和HCC1937细胞系中表达水平(±sn=3)
免疫荧光染色结果显示见图1,在MCF7细胞中,应用BRCA1(Ab-1)和BRCA1(D9)两种抗体检测都能观察到BRCA1在细胞核内有较强的染色,提示BRCA1蛋白以细胞核内分布为主。在HCC1937细胞,应用BRCA1(Ab-1)抗体未能在细胞核内观察到BRCA1的染色,提示变异的BRCA1在细胞核内的分布缺失;而在HCC1937 wtBRCA1细胞系中,BRCA1在细胞核内的染色增强。
图1免疫荧光染色观察BRCA1在MCF7和HCC1937细胞中的分布

2.在应答DNA损伤反应时,MCF7和HCC1937细胞系中的BRCA1功能特性比较:  结果如表2所示,在无IR照射条件下,MCF7细胞中BRCA1蛋白表达包括磷酸化(BRCA1-p)和非磷酸化(BRCA1)两种形式;应答DNA损伤反应后1 h,BRCA1表达全部为BRCA1-p型(t=336.37,P<0.05),表达带明显上移,BRCA1这一表现形式在IR照射后8 h仍能观察到。对于HCC1937细胞系,如表3所示,10 Gy照射前后,应用BRCA1(D9)抗体均没有检测到其表达,即使应用BRCA1(Ab-1)抗体也难以观察到。但是,当恢复wtBRCA1在HCC1937细胞系表达后,DNA损伤后的BRCA1表达全部转化为磷酸化型(表3),与其在MCF7细胞的变化一致。

表2不同照射时间下BRCA1蛋白在MCF7细胞中表达水平(±sn=3)
表3BRCA1蛋白在HCC1937及HCC1937 wtBRCA1细胞中表达水平(±s, n=3)
免疫荧光法观察的结果如表4所示。无IR处理的MCF7细胞中含有BRCA1焦点形成(BRCA1 foci formation)的细胞数占总细胞的比例为11.80%,10 Gy照射后8 h这一比例增至59.40%(P<0.05)。在HCC1937细胞中,IR处理前后均没有观察到BRCA1焦点形成;然而,恢复wtBRCA1蛋白在HCC1937细胞中表达后,IR-诱导的BRCA1焦点形成可由原来的18.20%升至87.10%(P<0.05),其表现与BRCA1在MCF7细胞中变化一致。
表4电离辐射诱导的BRCA1、Rad51蛋白焦点形成百分比(%,±sn=3)
表4还显示,MCF7细胞中含有Rad51的焦点(rad51 foci formation)的细胞数目占总细胞数的比例从IR前的16.70%升至IR后的73.90%(P<0.05)。但是,在HCC1937细胞中,Rad51的焦点细胞数的比例由IR前的1.14%仅增至12.80%(P<0.05);在HCC1937细胞中有wtBRCA1表达后,IR后Rad51的焦点形成的百分比由原来的6.22%增加至61.70%(P<0.05)。

3.p53在MCF7和HCC1937细胞系中的表达和功能的比较:  表5结果显示,在无IR处理的MCF7细胞中,p53及其下游调控基因p21仅有较弱的表达;10 Gy处理后8 h,观察到p53和p21都有明显的协调一致性增加(P<0.05),表明MCF7细胞中的p53可被DNA损伤激活,并有能力通过调控其下游基因p21以应答DNA损伤反应,提示MCF7细胞中的p53状态为野生型p53(wild type p53,wtp53),wtp53蛋白结构示意图见图2A。在HCC1937细胞系中,检测到位置下移的p53,其分子量接近37.6 kD,p53状态为变异型p53(mutation p53, mp53),mp53蛋白结构示意图见图2B;而且IR处理前后,mp53表达无明显变化(P>0.05),其下游基因p21未被诱导表达,表明在HCC1937中mp53无法激活其下游调控基因,细胞中p53~p21通路功能缺失,无法应答DNA损伤反应。

图2p53及mp53的功能域示意图
表5p53蛋白在MCF7和HCC1937细胞中表达水平(±sn=3)
免疫荧光结果图3显示:p53分布于MCF7整个细胞中,以细胞核内分布为主。但在HCC1937细胞中p53染色微弱,核内几乎无染色,即使恢复wtBRCA1在HCC1937细胞系中的表达,对p53染色也无影响。
图3免疫荧光染色分析p53在MCF7和HCC1937细胞内的分布

4.MCF7和HCC1937细胞系细胞周期特性的比较:  10 Gy辐射处理MCF7细胞后24 h,大多数细胞聚集在G1期,而蓄积在S和G2-M期的细胞相对较少,表明p53对细胞的G1-S期监测点有明显的调控作用,见图4。对于HCC1937细胞,相同条件处理后大多数细胞聚集在S和G2-M期,而G1期相对较少,提示该细胞对G1-S期调控能力的缺失;但当恢复wtBRCA1在HCC1937细胞表达时,HCC1937 wtBRCA1细胞在G2-M期进一步增多,提示BRCA1对G2-M期具有调控能力,而HCC1937细胞缺乏调控G2-M期监测点的能力。

图4流式细胞术检测MCF7和HCC1937的细胞周期
综合上述实验结果,HCC1937和MCF7两种乳腺癌细胞系在DNA损伤修复反应时功能的比较见表6
表6MCF7、HCC1937及HCC1937 wtBRCA1细胞系中与BRCA1和p53相关的功能状态比较

讨论  在细胞和分子生物学水平上进行乳腺癌相关研究时,选择和应用正确的乳腺癌细胞系是研究的关键因素之一[7,8,9,10]。本研究中,笔者比较了MCF7和HCC1937两种关键的乳腺癌细胞系在DNA损伤修复中的功能特性。研究证明,在MCF7细胞中BRCA1和p53均是野生型时,两种蛋白以细胞核内分布为主;应答DNA损伤反应时,BRCA1被磷酸化、p53-p21通路激活、Rad51所介导的DNA修复通路被活化、细胞的G1-S和G2-M期监测点完整。相反,在HCC1937细胞中,BRCA1和p53基因变异(截断突变),变异的两种蛋白在细胞核内分布缺失、变异的BRCA1失去了对DNA损伤的应答能力、p53~p21通路失活、修复因子Rad51介导的DNA修复调控通路失活以及G1-S、G2-M期监测点也双重缺失。以上表明,MCF7和HCC1937两种乳腺癌细胞系有功能性差异。
        HCC1937乳腺癌细胞系是Tomlinson等[11]在1998年建立的,研究证明在这一细胞系中BRCA1和p53基因存在变异。笔者与其他学者的实验结果都证明变异的BRCA1和p53可导致HCC1937细胞系在应答DNA损伤修复反应时出现功能异常[3,11,12],如BRCA1不能有效地被磷酸化等,可能与BRCA1状态有关。wtBRCA1的磷酸化主要发生于DNA复制的S和G2-M期以及应答DNA损伤修复反应中[7,8]。多种激酶如ATM、ATR、CHK2及CDK等,都可直接影响BRCA1在其多个不同位点的磷酸化[12],进而调控其对DNA复制和DNA损伤修复反应过程的应答。目前的实验结果还证明BRCA1 C-末端的两个BRCT(BRCA1 C-terminus)功能区在DNA复制和DNA修复反应中也起到关键的作用,具有调节者的作用;而且BRCT缺欠与乳腺癌的发生密切相关。在HCC1937细胞中,BRCA1基因在5382核苷酸处被插入C碱基,使其C-末端在1829密码子处被截断,导致BRCT功能区缺失,致使BRCA1的表达不稳定且表达量很低,通过免疫印迹法很难被检测到[3]或者所检测到的量相对较少。此外,变异的BRCA1不能有效地接受和传导DNA损伤修复通路的信号,不能行使调节者的作用。除了HCC1937细胞系,Elstrodt等[2]在2006年从41种乳腺癌的细胞系中筛选鉴定出MDA-MB-436、SUM149PT和SUM1315MO2三种带有BRCA1变异的细胞系。Wasielewski等[1]分析了这41种乳腺癌细胞中p53基因特点,只有9种乳腺癌细胞系的p53是野生型,包括MCF7细胞系;有32种细胞系伴有p53的基因突变,其中有22种细胞系含有p53的错义变异(missense mutations);有10种细胞系中p53是截断突变(truncating mutation),其中包括HCC1937细胞系。突变细胞系占整个被检测的41种乳腺癌细胞系的78%,进一步表明p53的基因变异在乳腺癌中很常见,至于p53基因突变对细胞功能状态的影响,尚需进一步深入的研究。
        综上所述,通过对MCF7和HCC1937两种乳腺癌细胞中BRCA1和p53诸多功能的鉴定和比较,提示在应答DNA损伤修复反应时,由于BRCA1和p53在MCF7和HCC1937细胞系中的功能不同,直接导致这两种细胞系在应答DNA损伤修复反应时的功能特性差别。因而,在应用相关的细胞系进行研究时,对细胞系的基因背景应给予足够的重视和了解,尤其是已经得到了学者们的普遍认可并广泛地应用于乳腺癌研究中的MCF7和HCC1937细胞系,增加对其细胞系背景的认识显得更为重要,本研究结果将为之提供实验依据,具有重要的参考价值。

参考文献
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