中华预防医学杂志    2016年03期 白细胞分化抗原-40基因SNP及其血清水平与缺血性脑卒中的相关性    PDF     文章点击量:2895    
中华预防医学杂志2016年03期
中华医学会主办。
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陈健明 黄华佗 袁秋然 罗宏成 向阳 王春芳 蒙兰青 韦叶生
ChenJianming,HuangHuatuo,YuanQiuran,LuoHongcheng,XiangYang,WangChunfang,MengLanqing,WeiYesheng
白细胞分化抗原-40基因SNP及其血清水平与缺血性脑卒中的相关性
Association of SNP of leukocyte differentiation antigen-CD40 gene and its serum level with ischemic stroke
中华预防医学杂志, 2016,50(3)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.03.010
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投稿日期: 2015-06-07
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白细胞分化抗原-40基因SNP及其血清水平与缺血性脑卒中的相关性
陈健明 黄华佗 袁秋然 罗宏成 向阳 王春芳 蒙兰青 韦叶生     
陈健明 533000 百色,右江民族医学院附属医院检验科
黄华佗 533000 百色,右江民族医学院附属医院检验科
袁秋然 533000 百色,右江民族医学院附属医院检验科
罗宏成 533000 百色,右江民族医学院附属医院检验科
向阳 533000 百色,右江民族医学院附属医院检验科
王春芳 533000 百色,右江民族医学院附属医院检验科
蒙兰青 533000 百色,右江民族医学院附属医院神经内科
韦叶生 533000 百色,右江民族医学院附属医院检验科
摘要: 目的  研究白细胞分化抗原-40(CD40)基因SNP及其血清水平与缺血性脑卒中(IS)易感性之间的关系。方法  选择2013年5月至2014年11月就诊于百色市某医院的缺血性脑卒中患者作为病例组,共202例。以同一时期在该医院门诊部进行体检的109名健康人群作为对照组。所有调查对象均来自广西壮族自治区,且相互间无血缘关系。经知情同意,每名调查对象均采集空腹静脉血3 ml,用单碱基延伸的PCR技术对CD40基因rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T和rs3765459 G/A多态性进行基因分型,同时采用ELISA检测血清CD40水平。采用t检验比较CD40血清水平在病例组与对照组间的差异及病例组中各位点不同基因型间的差异;采用χ2检验比较CD40基因不同位点基因型及等位基因在病例组和对照组中的分布差异,并以OR(95%CI)值表示相对风险。结果  病例组CD40基因rs1883832 C/T位点CC、CT、TT基因型频率分别为21.78%(44/202)、49.51%(100/202)、28.71%(58/202),对照组分别为33.17%(66/199)、48.74%(97/199)和18.09%(36/199),两组差异有统计学意义(χ2=9.57,P=0.008)。病例组CD40血清水平为(62.7±24.5) pg/ml,高于对照组[(45.3±17.2) pg/ml](t=8.97,P<0.001);病例组中rs1883832 C/T位点TT、CT基因型CD40血清水平分别为(65.9±26.3)、(64.3 ± 25.9)pg/ml,均高于CC基因型CD40血清水平[(55.1 ± 23.7)pg/ml](t值分别为5.34和5.03,P值均<0.001)。与rs1883832 C/T位点C等位基因携带者相比,T等位基因携带者患缺血性脑卒中的风险增加(OR=1.56, 95% CI:1.18~2.06)。联合基因型分析后发现,与对照组比较,病例组TCCA单倍型的携带者增加了缺血性脑卒中的发病风险(OR=2.49,95% CI:1.13~5.48)。结论  CD40基因rs1883832 C/T位点和TCCA单倍型与缺血性脑卒中的发病可能存在相关性,其中缺血性脑卒中的遗传易感基因可能是T等位基因。
关键词 :抗原,CD;多态性,单核苷酸;病例对照研究;基因;缺血性脑卒中
Association of SNP of leukocyte differentiation antigen-CD40 gene and its serum level with ischemic stroke
ChenJianming,HuangHuatuo,YuanQiuran,LuoHongcheng,XiangYang,WangChunfang,MengLanqing,WeiYesheng     
Department of Laboratory Medicine, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, China
Corresponding author: Wei Yesheng, Email:18777615132@163.com
Abstract:Objective  To investigate the association of SNP of CD40 gene and its serum levels with ischemic stroke (IS).Methods  A total of 202 IS patients from a hospital of Baise city were enrolled in case group from May 2013 to November 2014. At the same time, 109 healthy people who had physical check-ups in the outpatient department at the same hospital were enrolled in the control group. All participants were from Guangxi Zhuang Autonomous Region and unrelated to each other. 3 ml venous blood were collected on the premise of informed consent. The single nucleotide polymorphisms of CD40 gene rs1883832 C/T, rs13040307 C/T, rs752118 C/T and rs3765459 G/A were analyzed using a Snapshot SNP genotyping assays, and the serum levels of CD40 were tested by ELISA. t-test was used to compare the serum levels of CD40 between the case and control group, and the genotypes at different locuses in case group; χ2 test was used to compare the distribution differences of the CD40 gene locuses in different genotypes and allele between the case group and the control group; alleles was established as independent variables, the occurrence of the IS as dependent variable, and expressed relative risk with OR (95%CI) value.Results  In the case group, the frequency of CC, CT and TT genotypes in CD40 gene rs1883832 C/T were 21.78% (44/202), 49.51% (100/202) and 28.71% (58/202), respectively, and 33.17% (66/199), 48.74% (97/199), 18.09% (36/199) in the control group, respectively, the differences between the two groups was significant (χ2=9.57, P=0.008). The CD40 serum levels were (62.7±24.5) pg/ml in the case group, which was higher than that in the control group (45.3±17.2) pg/ml (t=8.97, P<0.001). The serum levels of TT and CT genotypes in CD40 gene were (65.9±26.3) and (64.3±25.9) pg/ml, respectively, and the differences were significant when comparing with CC genotype (t equaled 5.34 and 5.03, respectively, P<0.001). The risk of developing IS was 1.56 times higher in 1883832 T allele carriers than that in rs1883832 C allele carriers (OR=1.56, 95% CI: 1.18-2.06); Combined genotype analysis displayed that CD40 gene rs1883832 C/T, rs13040307 C/T, rs752118 C/T and rs3765459 G/A polymorphisms showed strong linkage disequilibrium, the case group TCCA haplotype was tested to be associated with a significantly increased risk of IS as compared with that in the control group(OR=2.49; 95%CI: 1.13-5.48).Conclusion  CD40 gene rs1883832 C/T polymorphism and its TCCA haplotype were possibly associated with ischemic stroke, and the susceptibility gene for ischemic stroke may be rs1883832 T allele.
Key words :Antigens, CD;Polymorphism, single nucleotide;Case-control study;Gene;Ischemic stroke
全文

缺血性脑卒中是严重危害我国中老年人健康的一种常见的脑血管疾病,其病因和发病机制虽尚未被完全阐明,但遗传基因在缺血性脑卒中发病过程中可能起着重要的作用[1]。随着人类基因组计划的迅速发展,缺血性脑卒中相关基因的定位和识别已成为研究的热点。白细胞分化抗原-40(CD40)是新近发现的一种属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,主要表达于免疫细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和血小板等[2,3,4],它可以促进炎症反应、参与动脉粥样硬化形成[5,6,7]。CD40基因位于20号染色体长臂上,研究表明,CD40基因突变和基因多态性可影响其功能及蛋白的表达,进而可能影响到CD40相关疾病的发生、发展和转归。但目前,国内外有关CD40基因与缺血性脑卒中的相关性研究较少。为此,本研究应用单碱基延伸的PCR技术和ELISA分析了CD40基因rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T和rs3765459 G/A多态性及CD40血清水平与缺血性脑卒中的关系,为认识缺血性脑卒中的发病机制提供一定的实验依据。

对象与方法  

一、对象  选择2013年5月至2014年11月就诊于百色市某医院的脑卒中患者作为病例组,脑卒中的诊断依据为全国第4届脑血管病诊断标准[8],所选择的患者均经头颅计算机体层摄影(computed tomography,CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)扫描进行确诊,排除由动脉炎、心源性、外伤、血液病、脑血管畸形、动脉瘤及药物或肿瘤等引起的脑卒中患者后,共计202例。以同一时期在该医院门诊部进行体检的健康人群作为对照组,所有对照组人群均无脑卒中,肝、肾、血液疾病,甲状腺疾病,自身免疫性疾病,妊娠和脑血管病史,共计199名。所有调查对象均来自广西壮族自治区,且相互间无血缘关系。调查对象均签署了知情同意书,本研究已获得右江民族医学院附属医院医学伦理委员会的批准。

二、试剂及仪器  

1.试剂:  热启动酶购于凯杰企业管理(上海)有限公司,虾碱酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)购于美国普洛麦格公司,外切酶Ⅰ购于上海拜力生物科技有限公司,多重SNP检测试剂盒(SNaPshot Multiplex kit)购于美国ABI公司,人可溶性CD40 ELISA试剂盒购于光晟生技公司。

2.仪器:  凝胶成像仪(JS-1080Mini,上海培清科技有限公司),紫外分析装置(FR-110,上海复日科技有限公司),电泳仪(FR-250,上海复日科技有限公司),电热恒温水槽(DK-8D,上海精宏实验设备有限公司),基因测序仪(ABI3130XL,美国ABI公司),基因遗传分析仪(3730XL,美国ABI公司),全自动酶标仪(RT-6000,深圳雷杜公司)。

三、方法  

1.基因组DNA提取:  采集调查对象空腹静脉血3 ml,加入EDTA-K2抗凝;采用改良碘化钠法提取白细胞基因组DNA,并置于-70 ℃保存备用。

2.引物设计与合成:  根据CD40基因rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T、rs3765459 G/A位点多态性和已知的DNA序列设计PCR引物(表1)。

表1CD40基因各位点PCR引物、单碱基延伸引物及片段长度

3.PCR扩增:  CD40基因的PCR扩增反应体积为20 μl,其中,10×PCR缓冲液2.0 μl,0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μl,上、下游引物各1.0 μl,模板DNA 1.0 μl,TaqDNA聚合酶1.0 U,超纯水14 μl。PCR反应条件:95 ℃预变性2 min后进入循环,94 ℃变性20 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,共循环35次,最后72 ℃延伸2 min,4 ℃保存。使用HotStarTaq进行多重PCR反应,获取产物,PCR产物经SAP和外切酶Ⅰ纯化后用SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用SAP纯化后在ABI3130XL上样。用GeneMapper 4.0软件进行SNP位点分型。

4.CD40血清水平的检测:  采用ELISA测定,结果用全自动酶标仪读取。各操作步骤均严格按照Human CD40 ELISA试剂盒说明书进行操作。

四、统计学分析  数据录入采用Excel 2010软件,核对无误后导入SPSS 11.5软件进行统计分析。年龄、CD40血清水平均符合正态分布,用±s表示。采用t检验比较CD40血清水平在病例组与对照组间的差异及病例组中各位点不同基因型间的差异。基因型和等位基因频率属于计数资料,采用频数和百分比进行描述,采用χ2检验比较其在病例组和对照组间的差异,并以OR(95%CI)值表示相对风险。以P<0.05为差异有统计学意义。应用在线软件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析病例组及对照组CD40基因rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T和rs3765459 G/A位点是否符合Hardy-Weinberg平衡,以P>0.05为符合Hardy-Weinberg平衡;同时分析上述位点连锁不平衡关系,连锁不平衡常数|D′|越接近1,提示两位点间历史上发生重组的可能性越小,则存在强烈的连锁不平衡。

结果  

一、基本情况  202例患者的年龄为(60.2±14.6)岁,男性138例,女性64例;199名对照组年龄为(65.1±10.7)岁,男性118名,女性81名。经检验,CD40基因rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T和rs3765459 G/A 4个位点在病例组(P值分别为0.942、0.834、0.588、0.606)及对照组(P值分别为0.972、0.895、0.521、0.691)中均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律;且4个位点间存在强烈的连锁不平衡:rs1883832 C/T与rs13040307 C/T的连锁不平衡常数|D′|=0.944;rs1883832 C/T与rs752118 C/T的连锁不平衡常数|D′|=0.951;rs1883832 C/T与rs752118 C/T的连锁不平衡常数|D′|=0.961;rs1883832 C/T与rs3765459 G/A的连锁不平衡常数|D′|=0.956。

二、基因型分布与缺血性脑卒中的关系  SNP分型结果显示,rs1883832 C/T、rs13040307 C/T和rs752118 C/T位点均检测到CC、CT和TT 3种基因型,而rs3765459 G/A位点检测到GG、GA和AA 3种基因型。rs1883832 C/T位点3种基因型频率在病例组与对照组中的分布差异有统计学意义(表2)。表3显示,rs1883832 C/T位点等位基因频率在两组人群中的分布差异亦有统计学意义;与C野生型等位基因携带者相比,携带T突变型等位基因的患者脑卒中的发生风险增加(OR=1.56,95%CI:1.18~2.06)。

表2对照组和病例组CD40基因各位点分布差异比较[n(%)]
表3对照组和病例组CD40基因各位点等位基因的分布差异比较及其与缺血性脑卒中发病风险的关系

三、CD40基因各位点联合分析及其与缺血性脑卒中发病风险的关系  联合基因型分析后发现,携带TCCA基因单倍型的患者与对照组比较增加了缺血性脑卒中的发病风险。详见表4

表4对照组和病例组CD40基因单倍型的分布差异比较及其与缺血性脑卒中发病风险的关系

四、CD40血清水平的比较  病例组CD40血清水平为(62.7±24.5) pg/ml,高于对照组[(45.3±17.2) pg/ml](t=8.97,P<0.001)。在病例组中,CD40基因rs13040307 C/T、rs752118 C/T和rs3765459 G/A位点各基因型之间CD40血清水平差异均无统计学意义(P>0.05);rs1883832 C/T位点TT、CT基因型CD40血清水平分别为(65.9±26.3)、(64.3 ± 25.9)pg/ml,均高于CC基因型CD40血清水平[(55.1 ± 23.7)pg/ml],差异均有统计学意义(t值分别为5.34和5.03,P值均<0.001)。

讨论  关于CD40基因多态性与疾病的关系,大部分都集中在动脉粥样硬化和急性冠状动脉综合征等疾病的研究上[9,10,11]。Ma等[12]报道,CD40基因rs1883832 C/T位点与缺血性脑卒中可能具有相关性,T等位基因可能是缺血性脑卒中的遗传易感基因。Zhang等[13]研究发现,CD40基因rs1883832 C/T位点各种基因型的分布频率差异具有统计学意义,T等位基因携带者在脑梗死的患者中高于对照组,提示,T等位基因在缺血性脑卒中的发病具有重要作用。Zhang等[13]进一步分析发现,CD40基因rs1883832 C/T位点影响CD40 mRNA和血浆CD40L水平的表达,TT基因型携带者CD40 mRNA和血浆CD40L水平高于其他基因型携带者,提示CD40基因rs1883832 C/T位点可能调控着CD40 mRNA的表达和血浆CD40L的浓度。本研究结果发现,病例组CD40基因rs1883832 C/T位点分布与对照组比较差异具有统计学意义,T等位基因携带者患缺血性脑卒中的风险是C等位基因的1.56倍,提示,T等位基因在缺血性脑卒中的发病中具有重要作用。联合基因型进一步分析发现,CD40基因rs1883832 C/T、rs13040307 C/T、rs752118 C/T和rs3765459 G/A SNP存在强烈的连锁不平衡,TCCA基因单倍型携带者与对照组比较增加了缺血性脑卒中的发病风险。
        动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,且是多种心脑血管疾病的病理基础。大量研究表明,CD40-CD40L系统在动脉粥样硬化的发生发展、血栓形成以及炎症反应等诸多环节中发挥重要作用[4,6,7,9,13]。作为炎性反应的标志物,CD40在临床上已被用来探测心脑血管疾病的危险性指标[5,12]。本研究结果发现,缺血性脑卒中患者血清CD40水平高于健康人群,提示,CD40可能参与了缺血性脑卒中的发生。为了进一步探讨CD40基因多态性与其血清水平的关系,本研究分析了CD40基因多态性与其CD40血清水平的联系,结果发现,CD40基因rs1883832 C/T多态性可影响血清CD40水平,携带T等位基因的缺血性脑卒中患者血清CD40水平高于不携带者,故认为,在病理条件下,携带T基因型的个体可以提高CD40的表达进而增加了缺血性脑卒中的发病风险。
        综上所述,缺血性脑卒中是由多因素共同参与所导致的一种常见病,除了环境因素所带来的影响之外,遗传基因在缺血性脑卒中的发生与发展中也起着重要的作用。

参考文献
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