中华预防医学杂志    2016年03期 纳米SiO2暴露对人支气管上皮细胞microRNA表达水平的影响    PDF     文章点击量:2577    
中华预防医学杂志2016年03期
中华医学会主办。
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杨亚蕊 何云 龚春梅 周继昌 朱玉梅 莫俊銮
YangYarui,HeYun,GongChunmei,ZhouJichang,ZhuYumei,MoJunluan
纳米SiO2暴露对人支气管上皮细胞microRNA表达水平的影响
Effect of SiO2 nanoparticles exposure on microRNA expression level in human bronchial epithelial cells
中华预防医学杂志, 2016,50(3)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.03.011
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投稿日期: 2015-06-30
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纳米SiO2暴露对人支气管上皮细胞microRNA表达水平的影响
杨亚蕊 何云 龚春梅 周继昌 朱玉梅 莫俊銮     
杨亚蕊 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系
何云 510080 广州,中山大学公共卫生学院预防医学系
龚春梅 深圳市慢性病防治中心分子生物实验室
周继昌 深圳市慢性病防治中心分子生物实验室
朱玉梅 深圳市慢性病防治中心分子生物实验室
莫俊銮 深圳市慢性病防治中心分子生物实验室
摘要: 目的  探讨纳米SiO2短期及长期暴露对人支气管上皮细胞(16HBE)microRNA(miRNA)表达水平的影响。方法  分别以5、10、15、20、25、30、40 μg/ml纳米SiO2溶液处理16HBE细胞24 h,采用CCK-8法检测细胞活性,并计算细胞增殖活性抑制率及半抑制浓度(IC50)。以10 μg/ml纳米SiO2溶液处理16HBE细胞至第10代(P10)和30代(P30),作为长期染毒组,并设立对照组(P0);以1/4 IC50、1/2 IC50、IC50浓度的纳米SiO2溶液和IC50浓度的微米SiO2溶液处理16HBE细胞24 h,作为短期染毒组,并设立无血清培养液组为对照组。用安捷伦miRNA微阵列芯片筛选P0、P10、P30组细胞差异表达的miRNA,并用逆转录荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法验证短期及长期染毒组与对照组miRNA的表达差异。结果  纳米SiO2溶液染剂量为5、10、15、20、25、30、40 μg/ml的16HBE细胞增殖活性抑制率分别为:(-3.33±3.80)%、(20.40±11.73)%、(39.08±5.53)%、(55.10±5.78)%、(66.42±9.60)%、(71.67±7.34)%、(81.43±5.37)%(F=129.11,P<0.001);IC50(95%CI)为18.35(15.82~20.72)μg/ml。长期染毒组中,P10、P30及P0细胞的miRNA-494-3p表达水平分别为0.45±0.08、0.28±0.07和1.00(F=60.77,P<0.001);miRNA-19a-3p表达水平分别为2.27±0.45、1.06±0.19和1.00(F=30.05,P<0.001);miRNA-148b-3p的表达水平分别为1.78±0.29、0.88±0.19和1.00(F=30.23,P<0.001)。短期染毒组中,5、10、20 μg/ml纳米SiO2溶液及20 μg/ml微米SiO2溶液染毒组的miRNA-494-3p表达水平分别为0.99±0.04、1.38±0.19、2.13±0.14、0.81±0.25(F=57.03,P<0.001);miRNA-19a-3p的表达水平分别为0.91±0.03、1.12±0.03、0.53±0.01、0.86±0.01(F=408.78,P<0.001);miRNA-148b-3p的表达水平分别为0.95±0.02、1.22±0.00、0.54±0.02、1.15±0.04(F=264.14,P<0.001)。结论  纳米SiO2短期及长期染毒可诱导16HBE细胞miRNA表达水平的变化,其中,长期和短期染毒对miRNA-494-3p的表达水平影响不同。
关键词 :二氧化硅;上皮细胞;微RNAs;微阵列芯片;逆转录聚合酶链反应
Effect of SiO2 nanoparticles exposure on microRNA expression level in human bronchial epithelial cells
YangYarui,HeYun,GongChunmei,ZhouJichang,ZhuYumei,MoJunluan     
Department of Preventive Medicine, School of Public Health, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China
Corresponding author: Gong Chunmei, Email:spring417@126.com
Abstract:Objective  To investigate the effect of short and long term exposure to SiO2 nanoparticles on microRNA expression level in human bronchial epithelial cells(16HBE cells).Methods  The 16HBE cells were exposed to 5, 10, 15, 20, 25, 30 and 40 μg/ml SiO2 nanoparticles for 24 h to detect the cell viability by using CCK-8 assay. The inhibition rate of proliferation activity and half inhibitory concentration (IC50) were calculated. The 16HBE cells were exposed to 10 μg/ml SiO2 nanoparticles for 10 and 30 generations, named P10 and P30, and the control P0 was set. The cells were treated with SiO2 nanoparticles at 0, 1/4 IC50, 1/2 IC50 and IC50 concentration and μm-SiO2 at IC50 concentration for 24 h, and the control serum-free culture medium was set. Agilent miRNAs microarray chip was used to screen differentially expressed miRNAs in P10, P30 and P0 groups. The expression level of miRNA was detected by reverse transcription fluorescence quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR).Results  The inhibition rate of proliferation activity of 5, 10, 15, 20, 25,30,40 μg/ml group were (-3.33±3.80)%, (20.40±11.73)%, (39.08±5.53)%, (55.10±5.78)%, (66.42±9.60)%, (71.67±7.34)%, (81.43±5.37)%, respectively; F=129.11, P<0.001. The IC50 (95%CI) was 18.35 (15.82-20.72) μg/ml. The expression level of miRNA-494-3p in P0, P10 and P30 were 1.00, 0.45±0.08, 0.28±0.07, respectively; F=60.77, P<0.001. miRNA-19a-3p were 1.00, 2.27±0.45, 1.06±0.19, respectively; F=30.05, P<0.001. miRNA-148b-3p were 1.00, 1.78±0.29, 0.88±0.19, respectively; F=30.23, P<0.001. Compared to control group, the expression level of miRNA-494-3p in 5, 10, 20 μg/ml SiO2 nanoparticles groups and 20 μg/ml μm-SiO2 group were 0.99±0.04, 1.38±0.19, 2.13±0.14, 0.81±0.25, respectively; F=57.03, P<0.001. miRNA-19a-3p were 0.91±0.03, 1.12±0.03, 0.53±0.01, 0.86±0.01, respectively; F=408.78, P<0.001. miRNA-148b-3p were 0.95±0.02, 1.22±0.00, 0.54±0.02, 1.15±0.04 respectively; F=264.14, P<0.001.Conclusion  Short and long term exposure to SiO2 nanoparticles can affect the expression level of miRNAs in 16HBE cells. The expressions of miRNA-494-3p after long and short period exposure are different.
Key words :Silica nanoparticle;Human bronchial epithelial cell;microRNAs;miRNAs microarray chip;qRT-PCR
全文

纳米SiO2已经广泛应用于化妆品、生物医学应用、打印机墨粉及食物等多个领域[1]。众所周知,以石英为代表的结晶型SiO2可致肺组织纤维化(矽肺),于1997年被国际癌症研究所(international agency for research on cancer,IARC)确定为Ⅰ类致癌物[2]。人们在工作和生活中接触纳米SiO2的机会较多,呼吸道暴露是其主要接触途径之一。多项体内外研究证实,纳米SiO2具有较广泛的毒性效应,可诱导氧化应激[3]、甲基化[4,5]、炎症反应[6]、DNA损伤[7],引起溶酶体功能障碍[8],影响肺泡-毛细血管屏障[9]等。其对人类健康和环境的潜在危害已成为纳米毒理学亟待解决的问题。
        应用在毒理学领域的表观遗传学研究手段为全面评价纳米材料的遗传毒性提供了新的思路和可能。目前,国内外关于microRNA(miRNA)在纳米SiO2致细胞损伤中的作用和机制的研究较为少见。miRNA是基因表观遗传微环境的基础之一,其为一类小型非编码RNA,由大约22个核苷酸组成[10]。miRNA通过调控其靶基因而参与调控细胞增殖、凋亡、分化、周期及器官发育[11]。本研究旨在分析细胞暴露于纳米SiO2后miRNA表达水平的变化,为纳米SiO2致人支气管上皮细胞(16HBE)损伤机制的探索提供新的思路和理论依据。

资料与方法  

1.试剂及仪器:  (1)试剂:16HBE细胞,购于美国加尼福利亚大学;MEM培养基、胎牛血清,均购自美国Gibco公司。纳米SiO2(15 nm)溶液,购自杭州万景新材料有限公司;微米级SiO2粉末(1~5 μm),购自美国Sigma公司。总RNA提取试剂盒(Trizol,美国life Technology公司),miRNA检测试剂盒(Bulge-LoopTM hsa-miRNA qRT-PCR Primer Set,广州锐博生物科技有限公司),反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT Reagent,日本TaKaRa公司),实时荧光定量试剂盒(SYBR? Premix Ex TaqTM,日本TaKaRa公司)。(2)仪器:酶标仪(Multiskan? FC,美国Thermo Scientific公司);生物分光光度计(Biophotometer,德国Eppendorf公司);电泳仪(1640300,美国Bio-Rad公司);PCR仪(S1000,美国Bio-Rad公司);真空浓缩仪(SPD111V,美国Savant公司);安捷伦芯片扫描仪(G2565BA,美国Agilent公司);荧光定量PCR仪(Light cycle 480,瑞士罗氏公司)。纳米SiO2和微米SiO2材料用无血清MEM培养基稀释到最大工作浓度,37 ℃放置24 h,其平均有效粒径分别为(14.6±0.3)nm、1~5 μm,与标注的粒径无明显差异;Zeta电位分别为-59.70和-13.23 mV,表明受试材料在分散体系中稳定性较好,样品纯度均达到99.9%以上,且未检出任何重金属元素。

2.细胞活性测定:  使用CCK-8法进行测定。16HBE细胞用含体积分数为10%胎牛血清的MEM培养液,在37 ℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度的环境中培养,按3×104个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中,待细胞生长至约70%汇合度时,分别以终浓度为5、10、15、20、25、30、40 μg/ml纳米SiO2的无血清MEM培养基处理24 h,并设无纳米SiO2对照组和空白对照组。处理结束后,每孔加入100 μl MEM培养基和10 μl 2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8),继续培养2 h。用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值(A)。实验设6个平行样。细胞增殖活性抑制率=(A对照组-A实验组)/(A对照组-A空白组)×100,并计算半抑制浓度(IC50)。

3.细胞长期及短期染毒处理:  根据IC50确定后续研究的暴露剂量。(1)长期染毒处理组:待16HBE细胞生长至约70%汇合度时,换用含有1/2 IC50浓度纳米SiO2的无血清培养液对细胞进行染毒处理24 h,再以1∶3传代接种。每代纳米SiO2染毒处理24 h,分别在第10代和30代收取细胞,分别标记为P10、P30;未经纳米SiO2溶液处理的16HBE细胞为对照组,记为P0。(2)短期染毒处理组:待细胞生长至约70%汇合度时,根据IC50结果,分别以1/4 IC50、1/2 IC50、IC50浓度的纳米SiO2和IC50浓度的微米SiO2处理16HBE细胞24 h,并设立无血清培养液为对照组。

4.总RNA抽提及其浓度、纯度测定:  收集1×107个细胞于1.5 ml EP管中,用预冷的PBS混匀,350×g,离心5 min,弃管内液体。加入1 ml Trizol试剂,混匀,室温静置5 min。加入200 μl氯仿,充分混匀振荡15 s,室温静置5 min。4 ℃,12 000×g,离心15 min。吸取500 μl上清液于新的1.5 ml EP管中,并加入500 μl异丙醇,轻轻混匀,室温静置10 min。4 ℃,12 000×g,离心10 min,弃上清。用体积分数为75%乙醇洗涤沉淀。4 ℃,12 000×g,离心5 min,弃上清。晾干,加入适量的焦炭酸二乙酯水(DEPC H2O)溶解。使用生物分光光度计测浓度及纯度(A260/A280)。

5.miRNA微阵列芯片:  分别取0.1 μg P0、P10、P30组细胞RNA与标记反应液混合,16 ℃孵育2 h后终止标记,并将样品置于真空浓缩仪中抽干,再溶解于18 μl超纯水中。样品与27 μl杂交反应液混合,100 ℃孵育5 min,冰浴5 min。12 000×g,离心2 min,收集反应液。55 ℃,20 r/min,与微阵列杂交20 h。杂交结束后,将微阵列置于洗涤溶液中洗涤3次。使用安捷伦芯片扫描仪对原始图像进行扫描,用Feature Extraction Software 10.7软件读取数据,采用Gene Spring Software 11.0软件进行归一化处理,所用的算法为Quantile。每个探针点的Flag值用A、P来表示,A表示该探针点信号与背景无差异,P表示该探针点信号与背景有差异。P10、P30细胞信号标准值比上P0细胞的信号标准值获得P10/P0和P30/P0标准值之比(即倍数差异),根据以下几条原则筛选芯片结果,进行聚类分析:(1)每组Flag值为P;(2)每组标准信号值>4;(3)P10/P0和P30/P0标准值比值均相差1.3倍以上或0.7倍以下作为基因差异表达的依据。在此基础上,依据P10/P0和P30/P0标准值比值是递增或递减,筛选出可进行后续逆转录荧光定量PCR(qRT-PCR)验证试验的miRNA。结合网站http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_entry.pl?acc=MI0003134,选择最终确定验证的miRNA。

6.qRT-PCR验证:  以U6 snRNA为内参进行qRT-PCR,检测miRNA在P0、P10、P30细胞及短期染毒组中的表达水平。细胞总RNA用特异逆转录引物进行反转录,逆转录反应体系为:总RNA2 μg,RT引物(500 nmol/L)2 μl,加超纯水至11 μl,70 ℃,10 min,冰浴2 min;5×PrimerScript缓冲液5 μl,PrimeScript逆转录酶混合物1.25 μl,加7.75 μl超纯水至25 μl。反转录反应条件为:42 ℃ 60 min,70 ℃ 10 min。Real-time PCR反应体系为:2×SYBR Premix Ex Taq II混合物10 μl,上游引物(5 μmol/L) 0.8 μl,下游引物(5 μmol/L) 0.8 μl,cDNA模板2 μl,加超纯水至20 μl。Real-time PCR仪执行如下程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,58 ℃ 20 s,70 ℃ 10 s,40个循环;95 ℃ 5 s,60 ℃ 60 s,95 ℃。每个样品设置3个复孔。

7.统计学分析:  数据录入采用Excel 2010软件,数据核对无误后导入SPSS 20.0软件进行统计分析;IC50计算采用GraphPad Prism软件。以U6 snRNA为内参,采用2-ΔΔCt法对基因表达进行相对定量,相对表达比值为2-ΔΔCt,ΔCt=Ct(miRNA)-Ct(U6)。qRT-PCR验证中,ΔΔCt=ΔCt(P0、P10或P30)-ΔCt(P0);不同剂量纳米SiO2及微米SiO2短期染毒组细胞miRNA表达差异分析中,ΔΔCt=ΔCt(染毒组)-ΔCt(对照组)。细胞增殖活性抑制率、miRNA表达量属于正态分布,数值用±s表示。采用单因素方差分析比较不同染毒剂量组间细胞增殖活性抑制率的差异及P10和P30与P0细胞间miRNA表达水平的差异;不同染毒剂量组间的两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.纳米SiO2暴露对16HBE细胞活性的影响:  纳米SiO2溶液染毒剂量为5、10、15、20、25、30、40 μg/ml的16HBE细胞增殖活性抑制率分别为:(-3.33±3.80)%、(20.40±11.73)%、(39.08±5.53)%、(55.10±5.78)%、(66.42±9.60)%、(71.67±7.34)%、(81.43±5.37)%(F=129.11,P<0.001)。提示,当纳米SiO2浓度达10 μg/ml时,细胞活性降低;随着纳米SiO2浓度进一步增高,细胞活性呈浓度依赖性降低;IC50(95%CI)为18.35(15.82~20.72)μg/ml。根据纳米SiO2对细胞活性影响的结果,选择10 μg/ml作为后续实验的长期纳米SiO2染毒剂量,选择5、10和20 μg/ml 3个剂量组作为后续纳米SiO2短期染毒剂量。

2.提取RNA的质量:  生物分光光度计测定的RNA浓度及纯度(A260/A280)均在1.8~2.0之间。表明,提取的总RNA浓度及纯度符合后续实验质量要求。

3.微阵列杂交结果:  微阵列杂交芯片分别检测到P0、P10、P30细胞2 007个人类miRNA,以倍数差异1.3或0.7为标准进行聚类分析(图1)。与P0相比,P10、P30表达逐渐上调的为25个,逐渐下调的为3个(表1)。其中,miR-148b-3p、miR-19a-3p、miR-494表达差异明显,进行后续qRT-PCR验证试验。

表1纳米SiO2长期染毒组16HBE细胞miRNA表达情况
图1纳米SiO2长期染毒组及对照组miRNA微阵列杂交结果

4.qRT-PCR验证结果:  表2显示,miR-494-3p与微阵列结果基本一致,其他miRNA与芯片结果不一致。

表2纳米SiO2长期染毒组及对照组16HBE细胞miRNA相对表达水平(±s,n=3)

5.qRT-PCR验证不同剂量纳米SiO2及微米SiO2短期染毒组细胞miRNA表达差异:  qRT-PCR结果显示(表3),随着纳米SiO2暴露剂量的增加,10、20 μg/ml纳米SiO2染毒组较对照组miRNA-494-3p的表达水平呈逐渐升高的趋势,并且同剂量微米SiO2染毒组的miRNA-494-3p表达水平比纳米SiO2组低。短期微米SiO2和纳米SiO2染毒组miRNA-494-3p、miRNA-19a-3p、miRNA-148b-3p表达差异均具有统计学意义。

表3不同剂量纳米SiO2及微米SiO2短期染毒对16HBE细胞miRNA相对表达水平的影响(±s,n=3)

讨论  本研究发现,纳米SiO2可引起16HBE细胞活性下降。有研究提出,特征性miRNA可作为纳米SiO2致肝损伤的生物标志物[12]。纳米SiO2暴露可能影响16HBE细胞miRNA的表达水平,且特征性miRNA的改变与纳米SiO2致细胞损伤效应相关。阵列杂交芯片是筛选差异表达miRNA的经典方法,而qRT-PCR被认为是目前验证miRNA差异表达的"金标准"[13]。本研究发现,纳米SiO2短期及长期染毒可诱导16HBE细胞miRNA表达水平发生变化。qRT-PCR验证发现,长期染毒中,miRNA-494-3p呈时间依赖性降低,与芯片结果一致,而miRNA-19a-3p、miRNA-148b-3p的qRT-PCR验证结果与芯片结果不一致;短期染毒中,miRNA-494-3p呈剂量依赖性增高。可见miRNA-494-3p可能在纳米SiO2致细胞急性损伤和慢性损伤中发挥着不同的作用。有研究报道称,人原代支气管上皮细胞在柴油排气颗粒急性染毒后,miRNA-494-3p高表达[14];同时,也有大量的研究发现,miRNA-494-3p在肺癌的发生发展中发挥着抑癌的作用[15,16]。miRNA-494-3p表达水平的改变对于纳米SiO2致细胞损伤机制的研究提供了新的思路。多数研究表明,SiO2颗粒的细胞毒性和其粒径有关,颗粒粒径越小,细胞的毒性作用越明显[17]。这可能是16HBE细胞高剂量微米SiO2和纳米SiO2短期染毒组miRNA-494-3p、miRNA-19a-3p、miRNA-148b-3p表达差异的原因。miRNA是一种十分重要的基因表达调控机制,通过发现其靶基因,明确相应miRNA的功能,进一步揭示疾病中许多基因表达沉默或活化的表观遗传学机制。根据miRNA靶基因预测网站mirwalk(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/),本研究发现,miRNA-494-3p的预测靶基因多是与细胞自噬、细胞周期、细胞凋亡等生物学功能相关的。miRNA表达异常可能是细胞损伤过程中的一个早期事件,而miRNA-494-3p在纳米SiO2致细胞损伤中的作用尚需要深入研究。

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