中华预防医学杂志    2016年03期 2011—2013年河南省肠炎沙门菌耐药与分子分型研究    PDF     文章点击量:9515    
中华预防医学杂志2016年03期
中华医学会主办。
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赵嘉咏 张玉凯 谢志强 潘静静 苏佳 穆玉姣 黄学勇 张白帆 夏胜利
ZhaoJiayong,ZhangYukai,XieZhiqiang,PanJingjing,SuJia,MuYujiao,HuangXueyong,ZhangBaifan,XiaShengli
2011—2013年河南省肠炎沙门菌耐药与分子分型研究
Characteristics of drug resistance and molecular typing research for Salmonella Enteritidis isolated in Henan province from 2011 to 2013
中华预防医学杂志, 2016,50(3)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.03.014
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投稿日期: 2015-04-27
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2011—2013年河南省肠炎沙门菌耐药与分子分型研究
赵嘉咏 张玉凯 谢志强 潘静静 苏佳 穆玉姣 黄学勇 张白帆 夏胜利     
赵嘉咏 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
张玉凯 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
谢志强 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
潘静静 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
苏佳 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
穆玉姣 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
黄学勇 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
张白帆 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
夏胜利 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所
摘要: 目的  分析2011—2013年河南省肠炎沙门菌临床分离株的耐药状况与分子分型。方法  收集2011年3月至2013年12月分离于河南省7个腹泻病多病原监测哨点医院的120株肠炎沙门菌,根据国际细菌性传染病分子分型监测网络公布的非伤寒沙门菌PFGE分型方法与美国临床与实验室标准协会沙门菌纸片法(Kirby-Bauer, K-B)药敏测试方案,对120株肠炎沙门菌进行8类抗生素的药敏测试与PFGE分子分型分析。结果  120株肠炎沙门菌中,77株分离自男性,43株分离自女性;从0~5岁低龄儿童中共分离78株(65.0%),其中6月龄至2岁婴幼儿57株(47.5%);分离时间集中于每年的5—10月份,其中3—4月份11株(9.2%),5—7月份48株(40.0%),8—10月份54株(45.0%),其余月份7株(5.8%),具有较典型的夏秋季节特征。120株肠炎沙门菌对氨苄西林的耐药率为50.0%(60株);对头孢他啶的耐药率为14.2%(17株),对头孢噻肟的耐药率为18.3%(22株);对头孢吡肟的耐药率为5.8%(7株);对萘啶酸的耐药率为61.7%(74株);对环丙沙星的耐药率为8.3%(10株),对诺氟沙星的耐药率为5.8%(7株);对庆大霉素的耐药率为42.5%(51株),对链霉素的耐药率为21.7%(26株);对氯霉素类抗生素的耐药率为30.0%(36株);对甲氧苄氨嘧啶的耐药率为11.7%(14株),对复方磺胺甲唑的耐药率为71.7%(86株);对四环素的耐药率为47.5%(57株)。120株肠炎沙门菌均对2种以上抗生素耐药,其中耐3~4种的为28株(23.3%),耐5~6种的为38株(31.7%),耐7~8种的为39株(32.5%)。经XbaⅠ酶切和PFGE电泳后,120株肠炎沙门菌共分为44种带型(EN1~EN44),各带型包含菌株数为1~35株不等,带型相似度在54.3%~100.0%之间,EN14、EN19分别包含35和29株菌,为该血清型主要优势带型。结论  河南省临床分离的肠炎沙门菌耐药状况比较严重,PFGE带型具有优势带型特点的同时又与其对应的耐药谱具有一定的关联性与聚集性。
关键词 :沙门菌,肠炎;分子分型;电泳,凝胶,脉冲场
Characteristics of drug resistance and molecular typing research for Salmonella Enteritidis isolated in Henan province from 2011 to 2013
ZhaoJiayong,ZhangYukai,XieZhiqiang,PanJingjing,SuJia,MuYujiao,HuangXueyong,ZhangBaifan,XiaShengli     
Institute for Infectious Disease Control and Prevention, Henan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Zhengzhou 450016, China
Corresponding author: Xia Shengli, Email:xiasl@hncdc.com.cn
Abstract:Objective  To investigate the antimicrobial resistance status and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) patterns of Salmonella Enteritidis (S.Enteritidis) strains in Henan province.Methods  S. Enteritidis strains were isolated from seven sentinel hospitals from March 2011 to December 2013. According to molecular typing and Salmonella (Kirby-Bauer, K-B) drug susceptibility testing method published by the international PulseNet bacterial infectious disease monitoring network and USA Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), we analyzed drug sensitivity of 8 kinds antibiotics and PFGE molecule characteristics of 120 S. Enteritidis isolates from seven sentinel hospitals.Results  Among 120 strains of S. Enteritidis, 77 were isolated from male patients, 43 from female patients. A total of 78 strains S. Enteritidis were isolated from young children ranged from 0 to 5 years old (65.0%), including 57 strains isolated from 6 months to 2 years old (47.5%). The isolated time mainly centralized on May to October of the year, 11 strains isolated in March-April (9.2%), 48 were in May-July (40.0%),54 in August-October (45.0%), 7 in other months, with a typical summer seasonal characteristics. The resistance rate of 120 strains S. Enteritidis to ampicillin was 50.0% (n=60); to ceftazidime was 14.2% (n=17), to cefotaxime was 18.3% (n=22); to cefepime was 5.8% (n=7); to nalidixic acid was 61.7% (n=74); to ciprofloxacin was 8.3% (n=10), to norfloxacin was 5.8% (n=7); to gentamicin was 42.5% (n=51); to streptomycin was 21.7% (n=26); to chloramphenicol was 30.0% (n=36); resistance to methicillin benzyl ammonium was 11.7% (n=14), compound sulfamethoxazole resistance rate was 71.7% (n=86); the tetracycline resistant rate was 47.5% (n=57). All 120 strains of S. Enteritidis had different levels of resistance to 8 kinds of antibiotics, all strains were multidrug resistant strains, 28 isolates were resistant to 3-4 kinds of antibiotics (23.3%), 38 isolates were resistant to 5-6 kinds of antibiotics (31.7%), 39 isolates were resistant to 7-8 kinds of antibiotics (32.5%). All 120 strains of S. Enteritidis were divided into 44 molecular patterns by digestion with XbaI and pulsed field gel electrophoresis. each pattern contained 1-35 strains with similarity ranged from 54.3%-100%. EN14 and EN19 were the main PFGE types, including 35 and 29 strains respectively.Conclusion  The status of drug resistance of clinical isolates of Salmonella in Henan province was rather serious, PFGE patterns showed advantages and partial strain's corresponding resistant spectrum have certain relevance and the same aggregation relationship.
Key words :Salmonella Enteritidis;Molecular typing;Electrophoresis, gel, pulsed-field
全文

沙门菌属是一种重要的人兽共患病原菌,也是近几年来食源性传染病暴发疫情的主要病原。根据卡芙曼-怀特(Kauffman-White)血清分型表可以分为2 700多个血清型,其中肠炎沙门菌是临床最常见的沙门菌致病血清型,其在动物、食品和低龄儿童中的感染率与致病力都很高[1,2]。目前,纸片法药敏测试(Kirby-Bauer,k-B)法与PFGE是国际上公认的食源性疾病研究与暴发调查、溯源的重要手段,被广泛应用于沙门菌及其他肠道腹泻病的多病原综合监测工作中[3,4]。本研究对2011年3月至2013年12月分离自河南省的120株肠炎沙门菌进行药敏测试与大片段DNA分子特征分析,为深入了解肠炎沙门菌的多重耐药及分子特性,指导临床合理用药和肠道传染病的防控提供科学依据。

材料与方法  

1.菌株:  于2011年3月至2013年12月在河南省腹泻病多病原监测系统设立的7个哨点医院中收集分离自患者的肠炎沙门菌,共120株。其中,2011年42株,2012年45株,2013年33株。

2.试剂与仪器:  (1)试剂:沙门菌科玛嘉鉴定培养基购自法国CHROMAgar公司,脑心浸液、Mueller-Hinton(M-H)琼脂及药敏纸片和分配器购自英国Oxoid公司,API20E肠杆菌科细菌鉴定板条购自法国BioMérieux公司,沙门菌诊断血清、Swarm Agar诱导软琼脂购自丹麦SSI公司,Seakem Glod琼脂糖购自美国LONZA公司,蛋白酶K购自瑞士Roche公司,限制性内切酶XbaⅠ购自宝生物工程(大连)有限公司,三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl:1 mol/L,pH 8.0)、乙二胺四乙酸溶液(EDTA:0.5 mol/L,pH 8.0)、5×三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸溶液缓冲液(TBE)购自北京索莱宝科技有限公司,GelRed染料购自美国Biotium公司。(2)仪器:VITEK浊度仪购自法国BioMérieux公司,去离子水系统购自美国Milipore公司,PFGE系统与凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

3.菌株的生化鉴定与血清分型:  从沙门菌科玛嘉显色平板上直接挑取淡紫色菌落转种脑心浸液平板,37 ℃培养16~18 h,0.85%生理盐水制备0.5麦氏浊度菌液,API20E肠杆菌科系统生化鉴定,确定为沙门菌后用沙门菌诊断血清进行O相玻片凝集分型,再利用Swarm Agar诱导软琼脂进行H相(1/2相)鞭毛诱导与血清凝集,生理盐水做自凝对照。根据Kauffman-White血清分型表确定对应血清型别[5]

4.药敏试验:  参照WHO推荐的K-B法[6],将肠炎沙门菌转种脑心浸液琼脂平板,37 ℃培养16 h后0.85%生理盐水制成0.5麦氏单位悬液。用无菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布于M-H平板表面,用分配器将药敏纸片压盖其上,15 min内送37 ℃温箱培养18 h以后测量各药敏纸片抑菌圈直径,参照美国临床与实验室标准协会2009年标准进行耐药表型判定,大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株。

5.PFGE分子分型:  按照国际Pulsenet网络实验室公布的沙门菌PFGE标准分型方法,对120株肠炎沙门菌进行分子分型,沙门菌标准株H9812作为分子量标记。限制性内切酶XbaⅠ(50 U),37 ℃酶切2 h。电泳参数:电压6 V/cm,脉冲时间2.2~63.8 s,线性转换,电场角度120°,电泳时间19 h,电泳液温度14 ℃。电泳结束后胶块用GelRed染料染色20 min后纯水清洗30 min凝胶成像仪拍照(曝光时间3.0 s,去过饱和成像)[7,8]

6.数据分析:  用BioNumerics6.0软件对电泳图谱进行数据分析,绘制聚类分析树状图。聚类算法为非加权配对平均法(UPGMA),电泳条带位置优化度(position tolerance, PT)1.5%,相似度100%认定为同一PFGE带型。

结果  

1.菌株情况:  120株肠炎沙门菌中77株分离自男性,43株分离自女性;0~5岁儿童共分离78株,占65.0%,其中6月龄至2岁婴幼儿分离57株(47.5%);分离时间多集中于每年的5—10月份,其中3—4月份11株(9.2%),5—7月份48株(40.0%),8—10月份54株(45.0%),其余月份7株(5.8%),具有较典型的夏秋季节特征。

2.药敏测试结果:  120株肠炎沙门菌对广谱合成类青霉素氨苄西林的耐药率为50.0%(60株);对三代头孢类抗生素头孢他啶的耐药率为14.2%(17株),对头孢噻肟的耐药率为18.3%(22株);对四代头孢类抗生素头孢吡肟的耐药率为5.8%(7株);对一代喹诺酮类抗生素萘啶酸的耐药率为61.7%(74株);对三代氟喹诺酮类抗生素环丙沙星的耐药率为8.3%(10株),对诺氟沙星的耐药率为5.8%(7株);对氨基糖苷类抗生素庆大霉素的耐药率为42.5%(51株),对链霉素的耐药率为21.7%(26株);对氯霉素类抗生素的耐药率为30.0%(36株);对增效磺胺类抗生素甲氧苄氨嘧啶的耐药率为11.7%(14株),对复方磺胺甲唑的耐药率为71.7%(86株);对四环素的耐药率为47.5%(57株)。120株肠炎沙门菌均对2种以上抗生素耐药,其中耐3~4种的为28株(23.3%),耐5~6种的为38株(31.7%),耐7~8种的为39株(32.5%),见表1

表1120株肠炎沙门菌对13种抗生素耐药情况

3.PFGE分子分型结果:  120株肠炎沙门菌经XbaⅠ酶切后共分为44种带型,分别命名为EN1~EN44。各带型包含菌株数为1~35株不等,带型相似度在54.3%~100.0%之间,其中,EN12包含2株菌,EN18、EN24、EN26各包含4株菌,EN30包含5株菌,EN14、EN19分别包含35和29株菌,为该血清型主要优势带型,其余37种带型仅包含1株菌。120株肠炎沙门菌PFGE带型与耐药谱之间的关系较为复杂,从型内看,EN14中17株菌的耐药谱相同(氨苄西林-甲氧西林-四环素-链霉素-萘啶酸-氯霉素-复方新诺明),EN19中11株菌的耐药谱相同(氨苄西林-甲氧西林-环丙沙星-四环素-链霉素-萘啶酸-氯霉素-诺氟沙星-复方新诺明),EN18中4株菌的耐药谱相同(氨苄西林-头孢噻肟-环丙沙星-四环素-萘啶酸-氯霉素-诺氟沙星);从型间看,不同带型对应的菌株表现为相同的耐药表,如EN19中8株菌与EN24型内菌株耐药谱相同(氨苄西林-甲氧西林-环丙沙星-四环素-链霉素-萘啶酸-氯霉素-诺氟沙星-复方新诺明),EN24中2株菌耐药表型与EN26中3株菌表型(氨苄西林-庆大霉素-甲氧西林-萘啶酸-氯霉素-复方新诺明)一致。在单菌株带型对应的耐药谱中,部分带型耐药表型一致,如EN4、EN5与EN6、EN42、EN44,其余带型无一致性或耐药谱呈现较高的相似性,见图1

图1河南省肠炎沙门菌脉冲场凝胶电泳聚类分析图谱

讨论  能引起人类食源性疾病的非伤寒沙门菌血清型众多[9,10]。河南省3年的监测数据显示,2011—2012年位居前三位的血清型分别是鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌和阿贡那沙门菌,2013年位居前三位的血清型分别是鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌和森芬伯格沙门菌,肠炎沙门菌占据着主要位置。河南省肠炎沙门菌血清型主要为(9,12:g,m:-),在我国为非伤寒沙门菌的主要血清型[11]
        细菌耐药是近年来医疗卫生机构面临的重大问题。由于临床过度治疗与抗生素的滥用,病原菌的耐药现象日益严重[12]。从本研究药敏测试结果可以看出,河南省以沙门菌为代表的肠道致病菌耐药问题十分严重,其对8种抗生素均存在不同程度的耐药,比较严重的有青霉素类、磺胺类、四环素类、氯霉素类、氨基糖苷类以及一代喹诺酮类,对临床常用药物三代喹诺酮类环丙沙星和诺氟沙星也存在一定的耐药。沙门菌的多重耐药情况也非常严重,临床分离菌株普遍对2~8种抗生素耐药,其中耐7~8种抗生素的菌株占总数的32.5%。这些多重耐药表型的出现一方面归因于病原菌的自发偶发性耐药突变,但更重要的原因在于抗生素的滥用和耐药基因的水平传递[13]。众所周知,目前细菌耐药在我国和世界范围内都已成为临床和公共卫生领域高度关注的问题,建立科学有效的细菌耐药监测体系,及时分析分享数据,指导农业、畜牧业和医疗部门合理规范用药,减缓细菌耐药突变和扩散速度,降低临床治疗成本,非常必要和迫切。
        PFGE是近年来快速发展的传染性病原菌分子分型技术。依托这种技术和网络化实验室实时监测、交换和比对数据,可以及时发现、识别聚集性病例,为食源性传染病早期预测预警,暴发疫情与突发公共卫生事件的调查与现场处置提供了强有力的武器[14,15]。本研究利用该技术分析了河南省肠炎沙门菌PFGE"指纹图谱"特征与优势带型,积累了分子流行病学基线数据;从分型结果来看,肠炎沙门菌基于XbaⅠ单酶切指纹图谱的分辨力是很有限的,这和其他研究人员的结果相同[16],对于暴发调查而言这样的分子流行病学依据是不足的,从实践经验看往往需要进行细菌双酶切指纹图谱分析(如BlnⅠ),才能提供更可靠的病例关联性和指向性。这些菌株虽然来自河南省7个不同的监测哨点医院,但无论从耐药性还是PFGE带型上均未表现出明显差异性和聚集性。同时,部分肠炎沙门菌的耐药表型与PFGE带型呈现聚类一致性,这种现象提示基于共同暴露源的菌株往往具有相同的基因和耐药表型特征,这种特征尽管存在变异性和不确定性,但在一定范围内可以成为及早发现聚集性病例的重要指征参数。同时,也要认识到只有结合病原学和流行病学信息,才能更好地把握疾病传播特点和发挥PFGE技术在疾病防控、突发公卫事件和疫情处置中的作用。

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