中华预防医学杂志    2020年02期 安徽省149例腹泻病例中的分离沙门菌耐药谱及耐药基因分析    PDF     文章点击量:359    
中华预防医学杂志2020年02期
中华医学会主办。
0

文章信息

栗薇薇 陈晴晴 张竹慧 撒楠 袁媛 孙永
LiWeiwei,ChenQingqing,ZhangZhuhui,SaNan,YuanYuan,SunYong
安徽省149例腹泻病例中的分离沙门菌耐药谱及耐药基因分析
Analysis of drug resistance pattern and genes of Salmonella.spp isolated from human infections in Anhui Province
中华预防医学杂志, 2020,54(2)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2020.02.014
引用本文:

文章历史

投稿日期: 2019-04-09
上一篇:2005—2018年中国5岁以下轮状病毒腹泻报告病例流行特征分析
下一篇:p16/Ki-67双染监测在高危型人乳头瘤病毒阳性人群中的分流效果评价
安徽省149例腹泻病例中的分离沙门菌耐药谱及耐药基因分析
栗薇薇 陈晴晴 张竹慧 撒楠 袁媛 孙永     
栗薇薇 安徽省疾病预防控制中心微生物检验室,合肥 230601
陈晴晴 安徽省疾病预防控制中心微生物检验室,合肥 230601
张竹慧 安徽省疾病预防控制中心微生物检验室,合肥 230601
撒楠 安徽省疾病预防控制中心微生物检验室,合肥 230601
袁媛 安徽省疾病预防控制中心微生物检验室,合肥 230601
孙永 安徽省疾病预防控制中心微生物检验室,合肥 230601
摘要: 目的  分析安徽省腹泻病例粪便及肛拭子标本中所分离沙门菌的耐药谱及耐药基因型。方法  选取分离自2017年4—10月安徽省腹泻病例粪便及肛拭子标本的149株沙门菌,采用玻片凝集法鉴定沙门菌血清型,采用微量肉汤稀释法测定所有菌株对14种抗生素药物的敏感性。选取其中耐头孢类抗生素的菌株,采用多重PCR方法对β-内酰胺酶编码基因blaTEMblaSHⅤblaOXA-1blaOXA-2blaPERblaCMYblaCTX-M,以及黏菌素耐药基因mcr-1和mcr-2进行检测。结果  腹泻病例年龄MP25P75)为5.0(1.1,38.5)岁,男性为92例,≤12岁病例占54.4%(81例)。149株沙门菌中,105株对除亚胺培南以外的其他13种抗生素均具有不同程度的耐药性,其中,对氨苄西林的耐药率最高,为55.0%(82株),53.0%(79株)的菌株同时对≥3类抗生素耐药(多重耐药),主要为鼠伤寒沙门菌(83.6%,46/55)和肠炎沙门菌(71.4%,20/28)。共检出53种耐药谱,最常见耐药谱为氨苄西林-氨苄西林/舒巴坦-四环素-氯霉素-头孢唑啉-甲氧苄啶/磺胺甲噁唑,共10株。60株耐头孢类抗生素菌株中,45株携带blaTEM-1基因的菌株,其中6株同时携带blaCTX-M-14基因,3株同时携带blaCTX-M-65基因;32株单独携带blaTEM-1耐药基因,且均对氨苄西林产生耐药性,其中31株对头孢唑啉产生了耐药性;2株未检出耐药基因。检出1株携带mcr-1基因的多重耐药菌。结论  安徽省沙门菌对氨苄西林耐药现象较严重,且多重耐药菌株较多;blaTEM-1型基因是检出的主要耐药基因;检出mcr-1基因提示应关注安徽省沙门菌多黏菌素耐药情况。
关键词 :沙门菌属;头孢菌素类;多粘菌素类;耐药性
Analysis of drug resistance pattern and genes of Salmonella.spp isolated from human infections in Anhui Province
LiWeiwei,ChenQingqing,ZhangZhuhui,SaNan,YuanYuan,SunYong     
Microbiological Laboratory, Anhui Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hefei 230601, China
Corresponding author: Sun Yong, Email: biosunyong@163.com
Abstract:Objective  To investigate the drug resistance pattern and drug resistance genotypes of Salmonella. spp isolated from fecal specimens and anal swabs of diarrhea cases in Anhui Province.Methods  The 149 strains of Salmonella.spp isolated from feces and anal swabs of diarrhea cases in Anhui Province from April to October 2017 were selected. The serotypes of Salmonella.spp were identified by slide agglutination. The susceptibility of all strains to 14 antibiotics were determined by micro-broth dilution method. Sixty of the cephalosporin-resistant antibiotics were selected. The β-lactamase encoding genes blaTEM, blaSHV, blaOXA-1, blaOXA-2, blaPER, blaCMY, blaCTX-M, and colistin resistance genes mcr-1 and mcr-2 were performed using the multi-PCR method.Results  Of the 149 diarrhea cases, the median (P25, P75) of the age was 5.0 (1.1, 38.5). The 92 of them were male and 54.4% were children. Of the 149 strains of Salmonella.spp, 105 strains had different degrees of resistance to 13 antibiotics other than imipenem. The resistance rate of ampicillin was 55.0% (82/149), which was the highest. 53.0% strains (79 strains) were multidrug resistant, main of which were Salmonella typhimurium and Salmonella enteritidis. A total of 53 resistance patterns were detected, and 10 strains were resistant to ampicillin-ampicillin/sulbactam-tetracycline-chloramphenicol-cefazolin-trimethoprim/sulfamethoxazole, which was the most common resistance pattern. Among the 60 cephalosporin resistant strains, 45 strains carried blaTEM-1, 6 of which also carried blaCTX-M-14 and 3 of which also carried blaCTX-M-65. All the 32 strains carried only blaTEM-1 show resistance to ampicillin and 31 of them show resistance to cefazolin. There were 2 strains showing negative results of gene detection. mcr-1 was detected in a multidrug resistant strain.Conclusion  The resistance of Salmonella.spp to ampicillin shows a serious situation in this region, and there were a number of multidrug resistant strains. The blaTEM-1 was the major drug resistance gene detected in this research. Detection of the mcr-1 suggests the emergence of surveillance to colistin resistance of Salmonella.spp in this area.
Key words :Salmonella;Cephalosporins;Polymyxins;Drug resistance
全文

沙门菌是引起感染性腹泻和细菌性食物中毒的重要致病菌之一,临床上常采用氟喹诺酮类药物和头孢菌素治疗其感染。然而,由于抗生素的广泛使用,沙门菌耐药现象日益严重,多重耐药菌株时有出现,部分菌株甚至同时对10种以上抗生素具有耐药性[1,2,3,4]。在其耐药机制中,对头孢菌素产生的耐药性,通常是由菌株产生的β-内酰胺酶水解其自身环状结构导致的,而β-内酰胺酶编码基因多位于质粒、转座子、整合子等可移动遗传原件上,因此耐药性可通过基因的水平转移而在不同菌株间传播[5]。β-内酰胺酶编码的基因型别多样,在中国沙门菌中以blaCTX-MblaTEMblaOXA型较为常见[6,7]。黏菌素类药物常被用于治疗由产碳青霉烯酶肠杆菌所导致的严重感染,其耐药性可由染色体突变产生,而相对于染色体突变不能水平转移的特性,质粒介导的耐药基因mcr-1近年来受到广泛关注[8]。近年来,有关从腹泻病例分离出沙门菌的耐药菌株,以及耐药基因的携带情况在中国多地区均有报道,但安徽省的相关研究数据较少[3,4]。本研究对安徽省149株分离自腹泻病例粪便标本的沙门菌的耐药表型进行检测,同时对菌株所携带的β-内酰胺酶编码基因和黏菌素类的耐药基因进行了分析。现将结果阐述如下。

材料和方法  

一、菌株来源  149株沙门菌分离自食源性疾病病原学监测中2017年4—10月安徽省由食品或怀疑为食品引起的,以腹泻症状为主诉就诊的腹泻病例粪便及肛拭子标本。菌株均由安徽省各市疾病预防控制中心分离鉴定后送至安徽省疾病预防控制中心,除1株乙型副伤寒沙门菌外,其他均为非伤寒沙门菌。

二、实验室检测  

1.血清分型试验:  采用玻片凝集法对149株沙门菌进行血清分型复核[9],沙门菌属分型血清由丹麦国家血清研究院生产,沙门菌诊断血清(60种)由宁波天润生物药业有限公司生产。

2.药敏试验:  采用临床与实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的微量肉汤稀释法对149株菌株进行药敏试验[9],并定量测定最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),根据抗生素敏感试验执行标准(CLSI M100-S28)中的MIC解释标准进行药敏试验结果判读[10]。药敏板由上海星佰生物技术有限公司生产,包含10类14种抗生素分别为:氨苄西林(ampicillin,AMP)、头孢他啶(ceftazidime,CAZ)、氨苄西林/舒巴坦(ampicillin/sulbactam,AMS)、亚胺培南(imipenem,IPM)、四环素(tetracycline,TET)、萘啶酸(nalidixicacid,NAL)、头孢西丁(cefoxitin,CFX)、氯霉素(chloramphenicol,CHL)、头孢噻肟(cefotaxime,CTX)、头孢唑啉(cefazolin,CFZ)、庆大霉素(gentamicin,GEN)、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(trimethoprim/sulfamethoxazole,SXT)、阿奇霉素(azithromycin,AZM)和环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)。质控菌株为大肠杆菌标准菌株(ATCC 25922),购于广东环凯微生物科技有限公司。

3.耐药基因检测:  采用多重PCR方法对60株耐头孢类抗生素的菌株进行β-内酰胺酶编码基因blaTEMblaSHVblaOXA-1blaOXA-2blaPERblaCMYblaCTX-M,以及黏菌素耐药基因mcr-1和mcr-2检测。检测试剂为北京卓诚惠生生物科技股份有限公司生产的12种沙门菌耐药基因多重PCR检测试剂盒。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,阳性基因片段进行单重PCR验证后由通用生物系统(安徽)有限公司进行测序。最终将测序结果通过美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的相似序列检索工具(basic local alignment search tool,BLAST)与NCBI数据库中的参比序列进行在线检索比对,确定基因亚型。

三、统计学分析  采用Excel 2010和R 3.6.1进行数据整理和统计学分析。149例腹泻病例年龄不符合正态分布,采用MP25P75)表示。

结果  

一、基本情况  分离出沙门菌的149例腹泻病例年龄的MP25P75)为5.0(1.1,38.5)岁。149株沙门菌中,分离自门诊病例为110株,住院病例为39株;分离自男性为92株,女性为57株;分离自儿童病例(≤12岁)占54.4%(81株)。149株沙门菌分为31个不同血清型,其中55株(36.9%)为鼠伤寒沙门菌,28株(18.8%)为肠炎沙门菌,20株(13.4%)为阿贡纳沙门菌,其余46株分散于28个不同血清型。

二、药敏试验结果及耐药谱  

1.药敏试验结果:  149株沙门菌中,44株(29.5%)对所测14种(10类)抗生素全部敏感,105株对除IPM以外的其他13种抗生素均具有不同程度的耐药性,其中,对AMP的耐药率最高,为55.0%(82株),对GEN和AZM的耐药率最低,均为2.7%(4株)。此外,对TET、AMS、CFZ、NAL、CHL、SXT的耐药率均在30%以上。详见表1

表1安徽省149株沙门菌对14种抗生素药敏试验结果

2.耐药情况:  149株沙门菌中,耐头孢类抗生素菌株共60株;耐药种类数<3类(含44株对所测抗生素全部敏感的菌株)的占47.0%(70株),53.0%(79株)的菌株同时对≥3类抗生素耐药,为多重耐药菌株;鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、阿贡纳沙门菌和其他种类沙门菌中,耐药种类数<3类的菌株分别占16.4%(9/55)、28.6%(8/28)、100.0%(20/20)和71.7%(33/46),耐药种类数≥3类的分别占83.6%(46/55)、71.4%(20/28)、0和28.3%(13/46)。

3.耐药谱情况:  149株沙门菌共检出53种耐药谱,最常见耐药谱为AMP-AMS-TET-CHL-CFZ-SXT,共10株。详见表2。最常见的耐药为AMP,共82株,分布于42种耐药谱中。在55株鼠伤寒沙门菌中,最常见耐药谱为AMP-AMS-TET-CHL-CFZ-SXT(9株);28株肠炎沙门菌中最常见耐药谱为AMP-AMS-NAL-CFZ(8株);20株阿贡纳沙门菌中,17株对所测抗生素全部敏感,2株对头孢类和CHL耐药,1株对AMP和AMS耐药,未发现多重耐药;其他血清型中最常见的耐药谱是TET-SXT(4株)。

表2安徽省149株沙门菌对主要耐药谱的耐药情况

三、耐药基因检测结果  60株耐头孢类抗生素的菌株中,45株携带blaTEM-1基因,其中6株同时携带blaCTX-M-14基因,3株同时携带blaCTX-M-65基因,同时携带blaCTXM-15blaSHV-12和blaCMY-2基因各1株;另外,检测出同时携带mcr-1和blaCTX-M-14两种基因,以及同时携带blaCTXM -65blaTEM-1blaCTX-M-15三种基因的菌株各1株,未检出blaPERblaOXA-2mcr-2基因。所有基因与NCBI数据库中参比序列比对相似度均在99%以上。单独携带blaTEM-1耐药基因为32株,均对AMP产生耐药性,其中31株还对CFZ产生了耐药性。2株未检出耐药基因。详见表3。此外,携带mcr-1基因的菌株来源于1例儿童病例,其耐药谱为AMP-AMS-TET- NAL-CHL-CTX-CFZ-GEN-SXT-CIP。

表3安徽省58株携带不同耐药基因沙门菌对青霉素类、头孢类耐药情况

讨论  随着抗生素的广泛使用,沙门菌耐药性已成为困扰全球各国的问题。本研究中沙门菌对AMP和TET耐药现象较为严重,与美国国家抗生素耐药监测系统2015年报告情况相似[11]。有研究显示对CIP的不敏感可能导致氟喹诺酮类药物治疗沙门菌感染的失败或反应延迟[10]。本研究中沙门菌对CIP的敏感性较低,这提示应当持续关注本地区沙门菌对CIP的耐药情况。头孢类抗生素中CFX的耐药率略低于CTX和CAZ,这可能与临床治疗中三代头孢相比二代头孢使用频率更高,从而造成二代头孢耐药率选择性降低有关,广东的相关研究中也出现类似结果[11]。本研究多重耐药沙门菌较多,鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的多重耐药率较其他血清型更高,与广东地区的情况类似[12,13,14]。我国报道的阿贡纳沙门菌常对TET、NAL表现出耐药性,且有一定比例的多重耐药株出现[4,15]。而本研究中的阿贡纳沙门菌并未发现多重耐药株,且对TET和NAL普遍较为敏感。
        β-内酰胺酶作为沙门菌对头孢类耐药的主要机制,其型别多样且对各种抗生素的水解能力亦不相同。其中,TEM-1型对青霉素类和一代头孢菌素具有较强的水解能力,是革兰阴性细菌中最常见的β-内酰胺酶[16]。大多数CTX-M型β-内酰胺酶主要导致对CTX和头孢曲松(Ceftriaxone)的高水平耐药性,其中CTX-M-15型可导致对CAZ的耐药性升高[17]。我国现有研究中,基因blaCTX-M-14blaCTX-M-15是许多地区腹泻沙门菌携带的主要耐药基因[18,19]。但本研究中检出的耐药基因以blaTEM-1为主,其中,32株仅携带blaTEM-1基因的菌株对AMP和CFZ具有较高的耐药率,但对二代(CFZ)和三代头孢菌素(CAZ和CTX)较敏感。而11株同时携带基因blaTEM-1blaCTX-M的菌株与之相比,普遍对CTX耐药,6株携带基因blaCTX-M-15的菌株同时对CTX和CAZ耐药。因此推测这些菌株中的TEM-1型β-内酰胺酶可能是导致对AMP和CFZ产生的耐药性的原因,而CTX-M型β-内酰胺酶则可能导致CTX和CAZ的耐药性。根据已有报道,blaCMY-2基因和blaSHV-12基因的携带可能与受试菌株对CAZ和CTX的耐药性相关[20,21]。本研究中沙门菌耐药表型与耐药基因型具有较高吻合度,但由于可能受到耐药基因的高表达、几种耐药基因的协同作用及其他耐药机制的参与等因素影响,耐药表型和基因型并非遵循严格的对应关系,且本研究中检测的基因种类有限,因此这些菌株的耐药机制有待进一步研究证实。值得注意的是,本研究检出一株携带黏菌素耐药基因mcr-1的菌株,该菌分离自儿童病例,且对包括三代头孢菌素在内的8类抗生素耐药。这可能会导致该病例临床治疗的难度增大。mcr-1基因在我国食品、人源等不同来源的沙门菌中均有检出[22,23],且这些菌株与本研究中的菌株均具有较为严重的多重耐药表型,这提示本地区在沙门菌耐药尤其是粘菌素耐药情况的监测上应引起进一步重视。

参考文献
[1]李薇薇,白莉,张秀丽,等.中国四省份规模化肉鸡生产全过程沙门菌的污染状况和耐药特征研究[J].中华预防医学杂志,2018,52(4):352-357. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.04.005.
[2]白莉,李薇薇,韩海红,等.河南省4家大型屠宰场中预冷后肉鸡胴体沙门菌污染水平及耐药状况分析[J].中华预防医学杂志,2018,52(2):124-128. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.02.002.
[3]林茂锐,周旋,李明友,等. 84株沙门菌耐药特征及分子分型结果分析[J].中国人兽共患病学报,2016,32(6):553-557. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.009.
[4]倪佳琳,马蓉,胡雪明,等. 159株沙门菌血清学鉴定和耐药性分析[J].中国卫生检验杂志,2013,23(4):1012-1014.
[5]JohnAC, MariaSK, MelitaAG, et al. Epidemiology, clinical Presentation, laboratory diagnosis, antimicrobial resistance, and antimicrobial management of invasive salmonella infections[J]. Clin Microbiol Rev, 2015, 28 (4): 901-937. DOI: 10.1128/CMR.00002-15.
[6]夏梦,张智洁,刘勇. 152株沙门菌临床分离株的耐药性及同源性分析[J].临床医学研究, 2014, 31(12): 2311-2317. DOI: 10.3969/j.issn.1671-7171.2014.12.009.
[7]胡立新,宋文琪,苏建荣,等.儿童感染沙门菌耐药特点及鉴定方法的研究[J].首都医科大学学报,2016,37(3):364-369. DOI: 10.3969/j.issn.1006-7795.2016.03.023.
[8]LiuYY, WangY, WalshTR, et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study[J]. Lancet Infect Dis, 2016,16(2): 161-168. DOI: 10.1016/S1473-3099(15)00424-7.
[9]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. GB 4789.4-2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验[EB/OL].[2019-04-21]. http://www.doc88.com/p-7764978792589.html.
[10]临床和实验室标准协会. CLSI. M100-S28,抗生素敏感试验执行标准[EB/OL].[2019-04-21]. http://www.doc88.com/p-3913712480663.html.
[11]Centers for Disease Control and Prevention. 2015 Human isolates surveillance report[EB/OL].[2019-04-21].https://www.cdc.gov/narms/reports/annual-human-isolates-report-2015.html.
[12]刘谢,柯碧霞,何冬梅,等. 2007—2013年广东省肠炎沙门菌耐药情况分析[J].中华疾病控制杂志,2015,19(3):269-272. DOI: 10.16462/j.cnki.zhjbkz.2015.03.015.
[13]龙冬玲,闫梅英,崔志刚,等. 2012—2016年深圳4家医院感染性腹泻来源非伤寒沙门菌耐药研究[J].中华预防医学杂志,2017,51(12):1118-1121. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.12.013.
[14]张晶,张欣强,侯水平,等.广州市566株腹泻病例沙门菌的血清型分布及耐药性分析[J].实用预防医学,2016,23(5):616-617,623. DOI: 10.3969/j.issn.1006-3110.2016.05.035.
[15]刘力彰,卢珊,赵素莲,等.中国非伤寒沙门菌主要血清型临床分离株耐药特征分析[J].疾病监测,2013,28(6):459-463. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.6.011.
[16]姚建平,黄永茂.TEM型β内酰胺酶的研究进展[J].中国感染与化疗杂志,2014,14(6): 550-555. DOI: 10.3969/j.issn.1009-7708.2014.06.022.
[17]RichardB. Growing Group of Extended-Spectrum-Lactamases: the CTX-M Enzymes[EB/OL].[2019-04-21].https://aac.asm.org/content/aac/48/1/1.full.pdf.
[18]WangJ, LiY, XuX, et al. Antimicrobial resistance of salmonella enterica serovar typhimurium in Shanghai, China[J]. Front Microbiol, 2017,8:510. DOI: 10.3389/fmicb.2017.00510.
[19]YuF, ChenQ, YuX, et al. High prevalence of extended-spectrum beta lactamases among Salmonella enterica Typhimurium isolates from pediatric patients with diarrhea in China[J]. PLoS One, 2011,6(3):e16801. DOI: 10.1371/journal.pone.0016801.
[20]CarattoliA, TosiniF, GilesWP, et al. Characterization of plasmids carrying CMY-2 from expanded-spectrum cephalosporin-resistant Salmonella strains isolated in the United States between 1996 and 1998[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2002,46(5):1269-1272. DOI: 10.1128/aac.46.5.1269-1272.2002.
[21]张哲,蒋晓飞,李敏,等. SHV-12型超广谱β-内酰胺酶特性的研究[J].检验医学,2006,21(1):31-34. DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2006.01.017.
[22]胡豫杰,赫英英,王晔茹,等.中国六省份零售整鸡中沙门菌血清型分布和耐药性特征研究[J].中华预防医学杂志,2018,52(4):372-377. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.04.008.
[23]曹阳,遇晓杰,韩营营,等.我国非伤寒沙门菌对多粘菌素的耐药现况及mcr-1基因携带概况[J].疾病监测,2017,32(5):365-371. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2017.05.005.