中华预防医学杂志    2020年02期 重复吸入阳离子胍类消毒剂引起小鼠肺的纤维化改变研究    PDF     文章点击量:610    
中华预防医学杂志2020年02期
中华医学会主办。
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祝肖肖 孟涛 冷曙光 郑玉新 唐敬龙
ZhuXiaoxiao,MengTao,LengShuguang,ZhengYuxin,TangJinglong
重复吸入阳离子胍类消毒剂引起小鼠肺的纤维化改变研究
Study on fibrosis changes in the lungs of mice caused by repeated inhalation of polyhexamethyleneguaidine disinfectant
中华预防医学杂志, 2020,54(2)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2020.02.016
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投稿日期: 2019-10-10
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重复吸入阳离子胍类消毒剂引起小鼠肺的纤维化改变研究
祝肖肖 孟涛 冷曙光 郑玉新 唐敬龙     
祝肖肖 青岛大学公共卫生学院 266021
孟涛 大同大学医学院 037009
冷曙光 青岛大学公共卫生学院 266021
郑玉新 青岛大学公共卫生学院 266021
唐敬龙 青岛大学公共卫生学院 266021
摘要: 目的  探讨重复吸入暴露消毒剂聚六亚甲基胍(PHMG)气溶胶的肺损伤及其毒理学特征。方法  将30只4周龄的C57BL/6N品系的小鼠随机分为对照组和低、高剂量组,每组雌雄各5只。以实验室Ⅱ级纯水作为溶剂对照;采用超声雾化含有PHMG水溶液产生气溶胶,低、高剂量组水溶液中PHMG浓度分别为0.1(0.01%)和1 mg/ml(0.1%),超声雾化后染毒室内PHMG的浓度分别为1.03和9.09 mg/m3。对实验小鼠进行动式呼吸暴露染毒,动物每天染毒4 h,共21 d。染毒结束后,使用肺灌洗细胞计数法对暴露后肺部炎性细胞进行评估,利用病理评价、特殊染色以及免疫组化的方法对肺部纤维化的关键指标进行评价。结果  与对照组相比,高剂量组体重出现明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组与对照组体重差异无统计学意义(P>0.05)。低剂量组小鼠肺灌洗液中炎性细胞数目降低,肺组织病理显示肺部发生损伤,伴随早期纤维化症状(P<0.05)。高剂量组可见肺组织纤维化改变。低、高剂量组肺纤维化标志物α-SMA均明显上调(P<0.05)。结论  吸入PHMG消毒剂能够引起小鼠肺部损伤,导致肺纤维化的发生,提示我们在工业生产和日常使用过程中,需要对这种常用消毒剂进行特殊的警示,并采取呼吸防护措施。
关键词 :肺纤维化;肺;毒性作用;聚六亚甲基胍;消毒剂
Study on fibrosis changes in the lungs of mice caused by repeated inhalation of polyhexamethyleneguaidine disinfectant
ZhuXiaoxiao,MengTao,LengShuguang,ZhengYuxin,TangJinglong     
School of Public Health, Qingdao University, Qingdao 266021, China
Corresponding author: Tang Jinglong, Email: tangjinglong@qdu.edu.cn
Abstract:Objective  To explore the lung damage caused by repeated inhalation of polyhexamethyleneguanidine (PHMG) disinfectant aerosol and the corresponding toxicological characteristics.Methods  Thirty four-week-old mice of C57BL/6N strain were randomly divided into three groups, the control group, low-dose group, and high-dose group. Each group had 5 male mice and 5 female mice. Lab II-level purified water was used in the control group. The PHMG disinfectant aerosol was generated by using the ultrasonic atomization of the aqueous solution containing PHMG. The PHMG concentrations in the low-and high-dose groups were 0.1 mg/ml (0.01%) and 1 mg/ml (0.1%), respectively. The concentration of PHMG in the post-chemical exposure room was 1.03 mg/m3 and 9.09 mg/m3 according to the air sampler analysis. The experimental mice were exposed to the PHMG in dynamic respiratory exposure mode for 4 hours every day in 21 days. After 21-day exposure, bronchia alveolus lung fluids (BALFs) were used to evaluate the inflammatory cells in the lungs, and pathological evaluation, special staining and immunohistochemical methods were further performed to evaluate the key indicators of pulmonary fibrosis.Results  Compared to the control group, the body weight of mice in the high-dose group was significantly decreased (P<0.05), while that of mice in the low-dose group did not significantly differ (P>0.05). The number of inflammatory cells in BALFs of low-dose exposed mice was slightly reduced, and the lung tissue pathology began to show lung damage with early fibrosis symptoms (P<0.05). The pathological examination of mice in the high-dose group showed changes in pulmonary fibrosis. Immunohistochemical staining showed that pulmonary fibrosis marker, α-SMA, was significantly increased in low-dose group and high-dose group (P<0.05).Conclusion  The repeated inhalation of PHMG disinfectant could cause lung damage such as pulmonary fibrosis in mice. It could suggest that special warnings should be given to this common disinfectant and respiratory protection measures should be adopted during industrial production and daily use.
Key words :Pulmonary fibrosis;Lung;Toxic actions;Polyhexamethyleneguanide;Disinfectant
全文

聚六亚甲基胍(polyhexamethyleneguanide,PHMG,CAS:57028-96-3)是一种高分子聚合物杀菌消毒剂,其分子式为(C7H16N3Cl)n。它对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、淋球菌等多种常见细菌具有完全杀灭作用[1,2]。由于其广谱的杀菌效果、优良的水溶性、作用速度快以及性质稳定等特性,被广泛应用于工业、农业、医疗和日常生活[3],生产和使用该产品的职业人群和一般人群,都可以广泛暴露于这类消毒剂。
        在加纳等非洲国家,PHMG被广泛用于生水消毒,急性毒性试验研究PHMG的经口半数致死量(median lethal dose,LD50)在500~1 000 mg/kg之间[4],因此推测生活接触PHMG不会引起明显的毒理学效应[5,6]。2006年,韩国爆发聚集性不明原因的肺纤维化损伤而导致死亡病例,后期的流行病学调查证实,家居中加湿器添加的消毒剂PHMG是其主要的致病因素[7]。自此PHMG吸入毒性问题引起关注,并有研究报道[8,9]。但是,这些研究大多是使用与人群暴露途径差异很大的气管滴注染毒方式,不能很好模拟人体暴露真实情景。本研究通过模拟真实气溶胶暴露,研究PHMG重复暴露的呼吸毒性,为制定人群暴露限值提供毒理学数据,警示公众使用PHMG消毒剂的健康危害,并对合理规范使用提供支持和指导。

材料与方法  

1.实验动物的选择与分组:  使用4周龄的C57BL/6N品系的小鼠30只,雌雄各15只,由北京维通利华公司提供,饲养于洁净级动物房内,适应性喂养2周[体重为(17.62±1.48)g]。采用完全随机设计分组的方法分为对照组、低剂量组、高剂量组。制作30个标签,将雌雄小鼠分别进行编号1~15之后,按照抽签法在雌雄两组分别随机抽取5个标签,将相应序号中的小鼠放入对照组、低剂量组、高剂量组。

2.仪器与试剂:  超声雾化器(深圳奇玩电子科技有限公司生产的超声雾化加湿器,喷雾量35~40 ml/h),意大利康帕斯公司正置光学显微镜,PHMG(上海高聚生物科技有限公司,CAS: 57028-96-3),甲醛(烟台三和化学试剂有限公司),α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA,武汉塞维尔生物科技有限公司),迪夫快速染色液(Diff-Quik染液,上海翊圣生物科技有限公司)。

3.染毒方法:  参考文献[10,11],依据加湿器消毒剂使用说明,PHMG推荐含量为0.1 mg/ml,Park等[10]预测室内的暴露浓度为0.945 mg/m3,所以本实验中分别以0.1和1.0 mg/ml作为低剂量和高剂量组,以实验室Ⅱ级纯水作为溶剂对照。利用超声雾化加湿器给小鼠进行呼吸暴露PHMG,每天4 h,连续暴露21 d。染毒过程中,对照组和低剂量组小鼠未发现任何异常,高剂量染毒组随着染毒时间增加,出现进食减少,体重下降的情况。利用伊红溶液吸收法测定暴露装置空气中低剂量组和高剂量组的浓度,在两个剂量组的染毒室内PHMG的浓度分别为1.03和9.09 mg/m3,低暴露剂量组与实际室内预测浓度相近。

4.小鼠肺灌洗液采样:  染毒结束后,用4%的水合氯醛(注射剂量为0.1 ml/10 g)腹腔注射麻醉小鼠,眼球取血后,对小鼠肺部进行预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)(pH 7.2~7.4)灌洗,每只小鼠灌洗3次,每次使用1 ml预冷的PBS。小鼠肺灌洗液按1 000×g离心5 min,离心后细胞团块用100 μl PBS重悬,进行总免疫细胞数计数。将重悬后的细胞悬液进行涂片,用Diff-Quik染色液进行染色,之后用光学显微镜进行细胞分类计数,包括巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞以及嗜酸性粒细胞,每张涂片共计400个细胞。

5.病理检查:  将解剖后的小鼠肺脏放在10%的中性福尔马林固定过夜,用石蜡进行包埋切片,对切片进行脱蜡至水,然后用HE染色液染色,最后经过脱水、透明、封片等步骤制作HE病理切片,由专科医生观察小鼠肺脏组织学改变。医生对实验分组情况未知,每张片子光镜下观察10个视野,分别依据肺毛细血管充血、肺泡腔内纤维蛋白渗出、中性粒细胞渗出、气道黏膜上皮细胞脱落、肺泡间隔增宽5项指标进行0~4半定量评分,并计算总分。用MT染色检测纤维化改变,步骤与HE染色方法类似,切片经过脱蜡至水后,分别用铁苏木素染液、酸性乙醇分化液、Masson蓝化液、磷钼酸溶液以及丽春红品红溶液着色后,脱水透明,用中性树胶封片,最后光学显微镜观察肺部胶原着色结果。

6.统计学分析用:  GraphPad Prism 7.0进行数据处理及绘图。小鼠体重、病理评分和肺灌洗细胞计数符合正态分布,以±s表示;采用单因素方差分析比较不同组小鼠体重、肺灌洗液细胞计数及病理评分差异,采用Dunnett-t检验比较对照组与低、高剂量组间的差异。双侧检验,检验水准α=0.05。

结果  

1.小鼠体重结果:  经过21 d的连续气溶胶吸入染毒,与对照组相比,高剂量组体重出现明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组与对照组体重差异无统计学意义(P>0.05)。详见图1

图1聚六亚甲基胍染毒21 d后不同暴露组小鼠的体重

2.肺灌洗液细胞计数:  与对照组相比,低剂量组肺灌洗液中细胞总量降低,高剂量组细胞总量升高,P值均<0.05(图2)。采用单因素方差分析比较后发现,发现随着暴露浓度的升高,肺灌洗细胞中巨噬细胞比例下降,淋巴细胞和中性粒细胞比例上升(表1),说明肺部局部发生炎症反应。

图2聚六亚甲基胍染毒21 d后不同暴露组小鼠肺灌洗液中细胞总量计数
表1聚六亚甲基胍染毒21 d后不同暴露组小鼠肺灌洗液中的不同亚细胞计数结果(±s

3.组织病理检查结果:  低、高剂量组小鼠肺脏均出现纤维化样改变。肺部HE病理切片检查发现,高剂量组和低剂量组与对照组相比,肺泡壁明显增厚,支气管和毛细血管周围有大量的炎性细胞浸润,肺泡内也有大量的炎性细胞和渗出液,肺泡塌陷不均匀分布,部分肺泡管扩张,通过统计病理评分发现,高剂量组小鼠肺部损伤更加严重。详见图3

图3聚六亚甲基胍染毒21 d后不同暴露组小鼠肺组织病理检查结果(HE染色,200×)

4.Masson染色观察纤维化改变:  PHMG暴露后肺组织出现胶原沉积,并且高剂量组胶原沉积更加明显,说明肺部出现纤维化(图4)。

图4聚六亚甲基胍染毒21 d后不同暴露组小鼠肺组织Masson染色情况(200×)

5.免疫组化染色观测肺纤维化标志物改变:  与对照组相比,低剂量组和高剂量组α-SMA蛋白在肺组织中均有不同程度的表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。α-SMA作为肺组织纤维化的一种重要的生物标志物,其上调说明了肺部纤维化的发生。

图5聚六亚甲基胍染毒21 d后不同暴露组小鼠肺组织α-SMA免疫组化分析结果(200×)

讨论  消毒杀菌精细化工品行业的研究报告显示,2013年我国PHMG的产量为1 000吨左右,并持续增加[12]。加纳大学的研究人员通过SD大鼠急性经口毒性试验计算出PHMG的LD50为600 mg/kg,并伴随轻微神经毒性症状[4]。由于其急性经口毒性很低,因此其吸入毒性的危害和风险就被忽视。
        2006年韩国"加湿器消毒剂中毒事件"使其呼吸毒性重新被审视[13]。韩国疾病预防控制中心通过流行病学研究确定了加湿器消毒剂中PHMG与相关肺部疾病的关系[14]。韩国毒理学研究所的研究团队采用气管滴注的方式研究了加湿器消毒剂PHMG暴露引起肺部纤维化的情况,发现单次暴露0.9 mg/kg PHMG后,肺部炎症反应和纤维化改变持续增加[15],并且比单次暴露1.5 mg/kg博来霉素更加严重[8,16]。另有研究表明,在1.5 mg/m3的呼吸暴露浓度下,实验动物肺部出现明显的不可逆的纤维化症状[17]。上述研究虽然在一定程度上确定了PHMG与肺损伤的关系,但是暴露方式与真实人群暴露存在较大差异,缺乏通过水溶性气溶胶吸入暴露与肺纤维化之间关系的研究。
        本研究中首次采用超声雾化制备PHMG气溶胶的方式,模拟真实的暴露场景,对实验小鼠进行21 d重复呼吸暴露PHMG。暴露过程中采用的浓度为大多数场所实际使用消毒剂PHMG的剂量,即0.01%和0.1%。利用加湿器发生雾态气溶胶能够模拟现实使用中的喷雾消毒以及消毒剂气溶胶等潜在暴露模式。通过重复的吸入暴露,发现实验小鼠体重、肺组织病理以及肺局部炎症等指标均出现了改变,揭示了亚慢性接触PHMG的潜在呼吸毒性风险。依据本研究结果,可以初步认为,PHMG经吸入最小可见损害作用水平(lowest observed adverse effect level,LOAEL)为1.03 mg/m3。如果以100倍的安全系数,则人的安全暴露水平在0.010 3 mg/m3以下。参考成人日最大摄入剂量(permitted daily exposure,PDE)公式=NOAEL×调整体重/(F1×F2×F3×F4×F5),其中F1为种属之间的换算系数,F2代表个体间的变异系数,F3为短期接触急性毒性研究的可变系数,F4为产生严重毒性情况的系数,F5为一个可用在无毒性反应的剂量时的可变系数,根据上述公式,则安全暴露水平应该为8.58×10-5 mg/m3
        本研究是我国首次对PHMG的呼吸毒性研究,其研究结论对于PHMG在我国的规范和合理使用具有重要现实意义。本研究结果提示,迫切需要保护一般人群和职业人群的呼吸系统免受此类生活中常用化学品的危害。PHMG相关产品在工业生产和日常使用过程中应该对其呼吸毒性进行安全警示,规范其使用范围,做好暴露防护措施。建议含有PHMG这类产品应该标示不能喷雾使用和避免吸入,相关管理部门也应全面评价PHMG的人群暴露范围和暴露水平,制定职业接触限值。另外,PHMG作为一种能引起小鼠肺纤维化的典型化学试剂,也可以利用其这一特性,替代博来霉素等药物,用于构建肺纤维化动物疾病模型研究肺纤维发病机制及治疗手段。

参考文献
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