中华预防医学杂志    2020年05期 五个结核分枝杆菌重组蛋白及其组合物的细胞免疫评价    PDF     文章点击量:91    
中华预防医学杂志2020年05期
中华医学会主办。
0

文章信息

闫宇涵 李马超 刘海灿 肖彤洋 李娜 楼永良 万康林
YanYuhan,LiMachao,LiuHaican,XiaoTongyang,LiNa,LouYongliang,WanKanglin
五个结核分枝杆菌重组蛋白及其组合物的细胞免疫评价
Cellular immunity evaluation of five mycobacterium tuberculosis recombinant proteins and their compositions
中华预防医学杂志, 2020,54(5)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112150-20191119-00872
引用本文:

文章历史

投稿日期: 2019-11-19
上一篇:浙江省原发性高血压和2型糖尿病社区管理指标与重大慢性病早死概率的相关性分析
下一篇:儿童青少年身体活动问卷效度和信度的Meta分析
五个结核分枝杆菌重组蛋白及其组合物的细胞免疫评价
闫宇涵 李马超 刘海灿 肖彤洋 李娜 楼永良 万康林     
闫宇涵 温州医科大学检验医学院生命科学学院 325035
李马超 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206
刘海灿 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206
肖彤洋 南方医科大学附属第二医院深圳市第三人民医院广东省新发传染病诊治重点实验室,广州 518112
李娜 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206
楼永良 温州医科大学检验医学院生命科学学院 325035
万康林 温州医科大学检验医学院生命科学学院 325035
摘要: 目的  对5个结核分枝杆菌重组蛋白及其组合物的细胞免疫进行评价。方法  88份新鲜肝素抗凝人群外周静脉血液,其中42份来自北京市昌平区结核病防治所就诊的结核病患者,46份健康志愿者由中国疾病预防控制中心传染病所提供,均为接种过卡介苗(BCG)且没有结核暴露史和任何临床症状体征的健康人。以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv DNA为模板,PCR扩增选取的5个重组蛋白Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c的完整编码基因;通过基因重组和蛋白纯化技术,分别克隆、表达和纯化5个重组蛋白作为刺激物,采用效应T细胞酶联免疫斑点试验(ELISPOT)对人群进行细胞免疫检测。结果  成功克隆、表达和纯化了Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c重组蛋白;灵敏度分别为50.00%、71.43%、69.04%、73.81%和76.19%;特异度分别为86.96%、76.09%、71.74%、39.13%和36.96%。阳性预测值、阴性预测值、曲线下面积及约登指数分别为52.46%~77.78%、62.96%~74.47%、0.511~0.754和0.129~0.475。除Rv1411c和Rv3418c外,Rv3874、Rv3875和Rv2031c在结核病患者中检测到的斑点形成细胞数均高于健康志愿者,差异均具有统计学意义(P值均<0.001)。在5个重组蛋白所构成的26种组合物中,灵敏度为80.95%~95.24%,特异度为68.89%~24.44%。随着组合物中重组蛋白个数的增加其灵敏度逐渐增加,但特异度随之下降。结论  结核分枝杆菌重组蛋白Rv3874、Rv3875和Rv2031c刺激T细胞产生免疫应答的能力较强,具有一定的抗原性。而Rv1411c和Rv3418c单独用作诊断抗原的效能并不理想,与多组分抗原联合构成的组合物具有一定应用价值。
关键词 :分枝杆菌,结核;重组蛋白质类;免疫,细胞;组合物;实验研究
Cellular immunity evaluation of five mycobacterium tuberculosis recombinant proteins and their compositions
YanYuhan,LiMachao,LiuHaican,XiaoTongyang,LiNa,LouYongliang,WanKanglin     
School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China
Corresponding author: Wan Kanglin, Email: wankanglin@icdc.cn
Abstract:Objective  The cellular immunity of 5 Mycobacterium tuberculosis recombinant proteins and their compositions was evaluated.Method  A total of 88 fresh venous blood from peripheral heparin anticoagulant population, 42 of which were from tuberculosis patients treated by The Tuberculosis Prevention and Treatment Center of Changping District, Beijing, and 46 of healthy volunteers were provided by the Infection Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention. Healthy volunteers without a history of tuberculosis exposure and any clinical signs and symptoms. Using the Mycobacterium tuberculosis standard strain H37Rv DNA as a template, complete genes of the selected 5 recombinant proteins Rv3874, Rv3875, Rv2031c, Rv1411c and Rv3418c by PCR amplified; 5 recombinant proteins were cloned, expressed and purified as stimulants by genetic recombination and protein purification techniques, and the effector T cell enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) was used to detect cellular immunity in the population.Results  The recombinant proteins Rv3874, Rv3875, Rv2031c, Rv1411c and Rv3418c were successfully cloned, expressed and purified; And the sensitivities were 50.00%, 71.43%, 69.04%, 73.81% and 76.19%, and the specificities were 86.96%, 76.09%, 71.74%, 39.13% and 36.96%. In addition, the positive predictive value, negative predictive value, area under the curve and Youden index were 52.46% to 77.78%, 62.96% to 74.47%, 0.511 to 0.754 and 0.129 to 0.475, respectively. Except for Rv1411c and Rv3418c, the number of spot-forming cell (SFC) detected by Rv3874, Rv3875 and Rv2031c in tuberculosis patients was higher than healthy volunteers, and the differences were statistically significant (P<0.001). Among the 26 compositions composed of 5 recombinant proteins, the sensitivity was 80.95% to 95.24%, and the specificity was 68.89% to 24.44%. As the number of recombinant proteins in the composition increases, the sensitivity gradually increased, but the specificity decreased.Conclusion  The recombinant proteins of Mycobacterium tuberculosis Rv3874, Rv3875 and Rv2031c have strong ability to stimulate T cells to produce immune response, and have certain antigenicity. The efficacy of Rv1411c and Rv3418c alone as diagnostic antigens is not ideal, and the composition composed of multi-component antigens has certain application value. This article provides experimental evidence for the immune diagnosis of tuberculosis and the preparation of new anti-tuberculosis vaccines.
Key words :Mycobacterium tuberculosis;Recombinant proteins;Immunity cellular;Compositions;Experimental study
全文

结核病主要是因呼吸道感染了结核分枝杆菌而引起的一种慢性传染病,目前仍然是严重威胁全球人类生命健康和社会经济发展的公共危机。据2019年世界卫生组织发布的全球结核报告显示,2018年结核病患者约1 000万例,其中死于结核病的例数约有124万[1]。虽然结核病发病率呈下降趋势,但由于耐药结核特别是耐多药和广泛耐药结核病的流行增加,全世界面临的挑战仍相当严峻。防控结核病的关键是要及早发现及时治疗,虽然一些分枝杆菌特异抗原已经用于结核病的免疫学诊断[2,3],但灵敏度或特异度都存在着较大差异,因此找到更多的免疫优势抗原对提高免疫诊断技术以及用于新型抗结核疫苗的制备具有相当重要的价值。本研究基于检索免疫学表位数据库结合生物信息学对结核分枝杆菌蛋白质组的抗原表位预测分析,筛选出具有特异性T细胞表位的抗原多肽的结核分枝杆菌蛋白的基础上,从中选择了Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和与Rv3418c 5个重组蛋白对人群进行细胞免疫的评价。根据Lalvani等[4],本研究采用了酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)对5个结核分枝杆菌重组蛋白及其组合物进行细胞免疫的初步评价[5,6,7],为筛选得到更多的结核分枝杆菌优势抗原以及进一步研究有效的免疫抗原组合奠定基础。

材料与方法  

一、样本  88份新鲜肝素抗凝人群外周静脉血液,其中42份来自北京市昌平区结核病防治所就诊的结核病患者,依据中华人民共和国国家卫生与健康委员会颁布的《WS 288-2017肺结核诊断》卫生行业标准,经临床和细菌学检测综合确诊的结核病患者;46份健康者由中国疾病预防控制中心传染病所提供,均为接种过卡介苗(bacillus calmette-guerin vaccine,BCG)且没有结核暴露史和任何临床症状体征的健康人。本研究由国家科技重大专项(2018ZX10731301-002)支持,课题研究内容获得中国疾病预防控制中心传染病预防控制所伦理审查委员会批准(批号:ICDC-2019010),所有对象均签署知情同意书。

二、主要试剂和仪器  

1.试剂:  结核分枝杆菌标准菌株H37Rv和表达载体pET-32a均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制国家重点实验室提供。感受态细胞DH5α、BL21和二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)法蛋白定量试剂盒(北京全式金生物技术有限公司);胶回收试剂盒、无内毒素质粒中提试剂盒和普通DNA产物纯化试剂盒(天根生化科技有限公司);限制性内切酶及T4 DNA连接酶(英国New England Biolabs公司);异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)(美国Amresco公司);细胞培养液1640(美国Hyclone公司);无血清细胞培养基AIM-V(美国Gibco公司);Ficoll淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限公司);结核分枝杆菌效应T细胞检测试剂盒(北京同生时代生物技术有限公司)。

2.仪器:  凝胶成像切胶仪(中国台湾GeneDireX公司);恒温摇床(上海智诚有限公司);大型高速冷冻离心机(日本Hitachi公司);超声细胞破碎仪(英国SANYO公司);XK-26层析柱和填料(美国GE公司);蛋白核酸检测仪(上海琪特有限公司);酶标仪(美国Bio-Rad);酶联免疫斑点分析仪(德国AID公司)。

三、重组蛋白克隆表达和纯化  

1.目的基因分子克隆:  通过美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)检索Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c完整基因序列,使用Primer Premier 5.0软件设计引物,引物由北京擎科生物技术有限公司合成,引物信息见下表1。以结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA为模板进行PCR扩增,得到的目的基因分别与载体pET-32a双酶切,在T4 DNA连接酶的作用下16 ℃连接过夜,分别把5个重组质粒转化到感受态细胞BL21中,接种于含氨苄青霉素(A+)(100 μg/ml)的溶菌肉汤(luria-bertani,LB)固体培养基上,37 ℃倒置培养过夜。

表1五个结核分枝杆菌重组蛋白目的基因引物信息表

2.重组蛋白表达与纯化:  次日挑取生长良好的单克隆菌落进行菌落PCR与测序验证。取验证后的1 ml菌液加入1 μl浓度为1 mmol/L的IPTG,37 ℃摇床180 rpm诱导表达3 h,十二烷基磺酸钠变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphonate denatured polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)验证重组蛋白表达。鉴定后大量诱导重组菌,诱导结束后超破离心SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达形式。采用Ni2+亲和层析分别对5个重组蛋白进行纯化。经咪唑浓度梯度洗脱获得的洗脱液用SDS-PAGE鉴定后,透析浓缩BCA法测定重组蛋白浓度。

四、人群细胞免疫评价  

1.外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的分离:  RPMI-1640培养基与全血1∶1稀释混匀,吸取稀释后血样沿管壁缓慢加入到Ficoll分离液液面上方,保持两液面界面清晰。使分离液、抗凝未稀释全血、RPMI-1640培养基体积比为1∶1:1,25 ℃,800×g离心20 min。离心管保持直立状态轻轻拿出,用吸管轻轻吸取白色云雾状细胞层并转移至15 ml无菌离心管中,加入RPMI-1640培养基至10 ml,25 ℃,800×g离心10 min。弃去上清,加入7 ml RPMI-1640培养基重悬细胞,25 ℃,700×g离心10 min。弃去上清,加入0.5 ml AIM-V培养基重悬细胞,轻轻混匀,取50 μl用全自动血细胞分析仪计数。

2.细胞与重组蛋白稀释:  用AIM-V培养基将PBMC稀释成终浓度为2.5×106/ml的细胞悬液,再用AIM-V培养基将5个重组蛋白分别稀释至20 μg/ml的最佳工作浓度[6]

3.检验步骤:  每个重组蛋白均设置4个检测孔,分别是空白对照孔(100 μl AIM-V培养基);检测孔(100 μl结核杆菌特异性抗原ESAT-6、CFP-10与Rv3615c);阳性质控孔(100 μl阳性刺激物PHA)和重组蛋白检测孔(100 μl重组蛋白)。每个检测孔加入100 μl细胞终溶液,37 ℃,体积分数5%的CO2培养箱中孵育20 h。后续检测步骤可参照文献[8]。利用酶联免疫斑点分析仪对斑点形成细胞(spot-forming cell,SFC)进行计数[9]

五、数据分析  结果参考判断标准[9],计算每个孔内的红色斑点数。将数据导入MedCalc 15.0软件中对5个重组蛋白进行统计学分析,绘制得到受试者工作特征(recetver operating characterrstic curve,ROC)曲线。通过GraphPad Prism 6.0软件绘制出5个重组蛋白检测的SFC箱式图。采用Mann-Whitney U秩和检验比较5个重组蛋白在结核组与健康组的差异。利用SPSS 20.0对5个重组蛋白的26种组合物进行多因素logistic回归模型分析,得到联合预测因子与金标准后做出ROC曲线,即可得到组合物的灵敏度与特异度。双侧检验,检验水准α=0.05。

结果  

一、目的基因分子克隆  经琼脂糖凝胶电泳验证特异性条带与目的基因大小一致,且Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c这5个结核分枝杆菌重组克隆子均成功构建。

二、重组蛋白表达纯化  菌落PCR鉴定结果显示,扩增得到的特异性条带与目的基因大小相符。Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c的测序结果与NCBI数据库中的目的基因序列比对结果均为100%。经SDS-PAGE鉴定,Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c均诱导表达出与预期大小相符的目的条带。通过Ni2+亲和层析得到纯度较高的5个重组蛋白。BCA法测定的Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c重组蛋白浓度分别为2 103.08、1 050.51、362.56、2 522.05和1 631.03 μg/ml。

三、人群细胞免疫检测结果  Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c的灵敏度分别为50.00%、71.43%、69.04%、73.81%和76.19%,特异度分别为86.96%、76.09%、71.74%、39.13%和36.96%;5个重组蛋白的曲线下面积均大于0.5,表明具有一定的诊断价值(图1表2)。重组蛋白检测的SFC箱式图(图2)显示,Rv3874、Rv3875和Rv2031c在结核病组检测到的SFC数均高于健康对照组,差异均有统计学意义(P值均<0.001);但Rv1411c和Rv3418c在结核病组与健康对照组中检测到的SFC数差异无有统计学意义(P值均>0.05)。

表2五个结核分枝杆菌重组蛋白酶联免疫斑点试验的诊断效能
图1五个结核分枝杆菌重组蛋白酶联免疫斑点试验诊断效能的受试者工作特征曲线
图2五个结核分枝杆菌重组蛋白刺激结核病患者和健康者后产生效应T细胞斑点数箱式图
此外,将2~5个重组蛋白进行随机组合,对得到的26种组合物灵敏度与特异度进行评价,组合物的诊断效能见表3。结果表明,组合物的灵敏度和特异度变化差异较大。26种组合物的灵敏度为80.95%~95.24%,特异度为68.89%~24.44%。随着组合物中重组蛋白个数的增加其灵敏度逐渐增加,但特异度随之下降。
表3五个结核分枝杆菌重组蛋白26种组合物酶联免疫斑点试验诊断效能

讨论  结核病主要是由感染了结核分枝杆菌而引起的一种慢性呼吸性传染病。目前结核病仍是引起全球范围内人类死亡的十大原因之一,且自2007年以来一直位居单一传染性疾病的死因之首。目前除BCG外尚无公认有效的抗结核疫苗[10]。其中制备结核疫苗关键的一点是要选择更多、更具有免疫保护性的优势抗原。
        本研究所用的结核分枝杆菌效应T细胞检测试剂盒采用了3种特异抗原的多肽片段(结核杆菌特异抗原ESAT-6、CFP-10和Rv3615c)作为阳性检测孔[11,12],以选取的5个重组蛋白作为抗原刺激物检测体内是否存在针对结核反应的效应T细胞,从而判断5个重组蛋白特异诊断结核病的效能。Rv3615c抗原表达依赖于结核杆菌差异区域(region of differences,RD),在BCG和大多数非结核分枝杆菌中都不存在,试剂盒的灵敏度有所增加,而特异性不受影响[13,14]
        本研究结果显示,5个重组蛋白的灵敏度与特异度差异较大。Rv3874与Rv3875是结核分枝杆菌的免疫优势抗原,可用于潜伏感染的诊断[3,15,16]。其中Rv3874的特异度最高,为86.96%。Rv3875的约登指数和曲线下面积最大,分别达到了0.475和0.754。Rv2031c编码产物是一种热休克蛋白HspX,HspX与潜伏感染相关并且作为一种免疫优势抗原可用于结核疫苗的制备[17,18]。Rv2031c的灵敏度与特异度分别为69.04%和71.74%。Rv3418c蛋白的编码基因是结核分枝杆菌中的必需基因,编码产物是分子量10kDa的伴侣蛋白GroES,主要与结核分枝杆菌毒力和适应性等有关[19]。Rv1411c的编码产物是一种保守的脂蛋白LprG,主要参与结核分枝杆菌细胞壁的加工和处理过程[20]。虽然Rv1411c和Rv3418c的灵敏度都相对较高,但特异度都较低。可见Rv1411c与Rv3418c单独用作诊断抗原的效果并不理想。本研究中5个重组蛋白的曲线下面积均大于0.5,表明仍具有一定的诊断价值。综上看出,特异度较好的重组蛋白灵敏度不好,而灵敏度较高的重组蛋白其特异度相对较差。
        文献报道单一抗原的诊断价值有限,不同的抗原组合诊断效能优于单一抗原组分[21,22]。本研究的26种组合物中,灵敏度与特异度的变化差异较大。随着组合物中重组蛋白数量的增加其灵敏度逐渐增加,但特异度呈逐渐降低趋势。当组合中的重组蛋白数量超过3个时,特异度降至40%以下。综上所述,组合的诊断性能并非是重组蛋白数量越多越好,而是需要探索其性能互补的最佳组合。本研究验证的Rv3874、Rv3875、Rv2031c、Rv1411c和Rv3418c这5个结核分枝杆菌重组蛋白及组合物为结核病的免疫诊断以及新型抗结核疫苗的制备奠定了基础。
        本研究的不足之处在于检测样本的数量有限,采集的88份血样仅能作为初步评价,后续还应扩大样本量或进行动物实验对免疫原性做进一步的验证;此外有研究发现部分结核病患者的血清学检测为阴性[23],而机体抵抗结核分枝杆菌感染的机制主要是依靠细胞免疫发挥作用,后续还可通过间接ELISA法对5个重组蛋白的血清学诊断价值做进一步的探索。

参考文献
[1]World Health Organization. Global tuberculosis report 2019[EB/OL]. [2019-12-31]. https://www.who.int/tb/publications/global_report/en/.
[2]ShakibamehrN, MosavariN, BabaieM, et al. Evaluate the efficiency of Antigen 60 (A60) protein from BCG strain of Mycobacterium bovis as a diagnostic antigen[J]. Int J Mycobacteriol, 2016,5Suppl 1:S226-S227. DOI: 10.1016/j.ijmyco.2016.10.022.
[3]BekmurzayevaA, SypabekovaM, KanayevaD. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis[J]. Tuberculosis(Edinb), 2013, 93(4): 381-388. DOI: 10.1016/j.tube.2013.03.003.
[4]LalvaniA, PathanAA, McShaneH, et al. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2001, 163(4): 824-828. DOI: 10.1164/ajrccm.163.4.2009100.
[5]李晓琴,肖彤洋,李马超,等.结核分枝杆菌Dnak和MPT83蛋白的抗原性评价[J].中华微生物学和免疫学杂志,2019, 39(2): 106-113. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2019.02.005.
[6]WangX, ChenS, XuY, et al. Identification and evaluation of the novel immunodominant antigen Rv2351c from Mycobacterium tuberculosis[J]. Emerg Microbes Infect, 2017,6(6):e48. DOI: 10.1038/emi.2017.34.
[7]XiaoTY, LiuHC, LiXQ, et al. Immunological Evaluation of a Novel Mycobacterium tuberculosis Antigen Rv0674[J]. Biomed Environ Sci, 2019, 32(6): 427-437. DOI: 10.3967/bes2019.056.
[8]DengY, LiuY, LiY, et al. Isolation measures and protection awareness are significant for latent tuberculosis infection: a cross-sectional study based on T-SPOT. TB among health care workers in China[J]. Epidemiol Infect, 2019,147:e120. DOI: 10.1017/S0950268818002777.
[9]余述凤,王学中 . T-SPOT在肺结核中的诊断价值[J].临床肺科杂志,2015,20(7):1237-1240.
[10]AndersenP. TB vaccines: progress and problems[J]. Trends Immunol, 2001, 22(3): 160-168. DOI: 10.1016/s1471-4906(01)01865-8.
[11]QiuY, WangY, LinN, et al. Multicenter clinical evaluation of three commercial reagent kits based on the interferon-gamma release assay for the rapid diagnosis of tuberculosis in China[J]. Int J Infect Dis, 2015,40:108-112. DOI: 10.1016/j.ijid.2015.09.004.
[12]TanS, LinN, HuangM, et al. CTL immunogenicity of Rv3615c antigen and diagnostic performances of an ESAT-6/CFP-10/Rv3615c antigen cocktail for Mycobacterium tuberculosis infection[J]. Tuberculosis(Edinb), 2017,107:5-12. DOI: 10.1016/j.tube.2017.07.011.
[13]MillingtonKA, FortuneSM, LowJ, et al. Rv3615c is a highly immunodominant RD1 (Region of Difference 1)-dependent secreted antigen specific for Mycobacterium tuberculosis infection[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(14): 5730-5735. DOI: 10.1073/pnas.1015153108.
[14]LiJ, ShenJ, LaoS, et al. Mycobacterium tuberculosis Rv3615c is a highly immunodominant antigen and specifically induces potent Th1-type immune responses in tuberculosis pleurisy[J]. Clin Sci (Lond), 2017,131(15): 1859-1876. DOI: 10.1042/CS20170205.
[15]PaiM, DenkingerCM, KikSV, et al. Gamma interferon release assays for detection of Mycobacterium tuberculosis infection[J]. Clin Microbiol Rev, 2014, 27(1): 3-20. DOI: 10.1128/CMR.00034-13.
[16]van PinxterenLA, RavnP, AggerEM, et al. Diagnosis of tuberculosis based on the two specific antigens ESAT-6 and CFP10[J]. Clin Diagn Lab Immunol, 2000, 7(2): 155-160. DOI: 10.1128/cdli.7.2.155-160.2000.
[17]Yousefi AvarvandA, KhademiF, TafaghodiM, et al. The roles of latency-associated antigens in tuberculosis vaccines[J]. Indian J Tuberc, 2019, 66(4): 487-491. DOI: 10.1016/j.ijtb.2019.04.012.
[18]WieczorekAE, TroudtJL, KnabenbauerP, et al. HspX vaccination and role in virulence in the guinea pig model of tuberculosis[J]. Pathog Dis, 2014, 71(3): 315-325. DOI: 10.1111/2049-632X.12147.
[19]AravindhanV, ChristyAJ, RoyS, et al. Mycobacterium tuberculosis groE promoter controls the expression of the bicistronic groESL1 operon and shows differential regulation under stress conditions[J]. FEMS Microbiol Lett, 2009, 292(1): 42-49. DOI: 10.1111/j.1574-6968.2008.01465.x.
[20]DrageMG, TsaiHC, PecoraND, et al. Mycobacterium tuberculosis lipoprotein LprG (Rv1411c) binds triacylated glycolipid agonists of Toll-like receptor 2[J]. Nat Struct Mol Biol, 2010, 17(9): 1088-1095. DOI: 10.1038/nsmb.1869.
[21]López-RamosJE, Macías-SeguraN, Cuevas-CordobaB, et al. Improvement in the Diagnosis of Tuberculosis Combining Mycobacterium Tuberculosis Immunodominant Peptides and Serum Host Biomarkers[J]. Arch Med Res, 2018, 49(3):147-153.e1. DOI: 10.1016/j.arcmed.2018.07.003.
[22]WuX, YangY, ZhangJ, et al. Comparison of antibody responses to seventeen antigens from Mycobacterium tuberculosis[J]. Clin Chim Acta, 2010, 411(19-20): 1520-1528. DOI: 10.1016/j.cca.2010.06.014.
[23]LyashchenkoK, ColangeliR, HoudeM, et al. Heterogeneous antibody responses in tuberculosis[J]. Infect Immun, 1998,66(8):3936-3940.