中华预防医学杂志    2020年06期 2017年山东省戊型肝炎病毒基因型分布及分子流行病学特征    PDF     文章点击量:147    
中华预防医学杂志2020年06期
中华医学会主办。
0

文章信息

颜丙玉 吕静静 冯艺 吴文龙 刘甲野 徐爱强 张丽
YanBingyu,LyuJingjing,FengYi,WuWenlong,LiuJiaye,XuAiqiang,ZhangLi
2017年山东省戊型肝炎病毒基因型分布及分子流行病学特征
Genotype distribution and molecular epidemiology of hepatitis E virus isolated in Shandong Province of China in 2017
中华预防医学杂志, 2020,54(6)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112150-20200311-00315
引用本文:

文章历史

投稿日期: 2020-03-11
上一篇:基于哨点医院电子病历计算机自动识别技术的流感样病例试点监测评价
下一篇:饮水和食物中可溶性硅酸与人体健康的关系
2017年山东省戊型肝炎病毒基因型分布及分子流行病学特征
颜丙玉 吕静静 冯艺 吴文龙 刘甲野 徐爱强 张丽     
颜丙玉 山东省疾病预防控制中心免疫预防管理所 山东省传染病预防控制重点实验室,济南 250014
吕静静 山东省疾病预防控制中心免疫预防管理所 山东省传染病预防控制重点实验室,济南 250014
冯艺 山东省疾病预防控制中心免疫预防管理所 山东省传染病预防控制重点实验室,济南 250014
吴文龙 山东省疾病预防控制中心免疫预防管理所 山东省传染病预防控制重点实验室,济南 250014
刘甲野 山东省疾病预防控制中心免疫预防管理所 山东省传染病预防控制重点实验室,济南 250014
徐爱强 山东省疾病预防控制中心免疫预防管理所 山东省传染病预防控制重点实验室,济南 250014
张丽 山东省疾病预防控制中心免疫预防管理所 山东省传染病预防控制重点实验室,济南 250014
摘要: 目的  分析2017年山东省戊型肝炎病毒(HEV)的基因型分布和分子流行病学特征。方法  选取山东省2017年1—12月通过国家法定传染病报告系统报告的戊型肝炎病例为研究对象,对其进行个案调查,并采集其血清标本,共1 045例。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法复核检测HEV-IgM和HEV-IgG抗体,对HEV-IgM阳性者的血清提取病毒核酸,采用逆转录PCR方法扩增HEV开放式阅读框架2区域内长度为644 bp的核苷酸片段,直接测序后与GenBank下载的参考病毒株序列进行同源性和系统进化分析。结果  HEV-IgM复核检测阳性者638例(61.1%),其中男性病例年龄为(57.9±12.2)岁,阳性率为61.5%(496/807),女性病例年龄为(58.1±15.0)岁,阳性率为59.7%(142/238);复核检测阳性者中共检出163株HEV毒株,检出率为25.6%(163/638),其中,东、中和西部地区检出率分别为23.0%(71/309)、33.6%(72/214)和17.4% (20/115)。检出的163株HEV病毒株均属于基因Ⅳ型,以4d亚型为主,占85.9%(140株),其次为4b亚型(7.4%,12株),以及少量的4a和4h亚型,分别占3.7%(6株)和3.1%(5株)。4a、4b和4h基因亚型组病例以东部为主,分别占3/5、11/12和4/6;4d基因亚型组以中部为主,占50.0%(70/140)。163株HEV的核苷酸序列同源性为82.7%~100.0%,其中140株HEV 4d亚型毒株与山东省猪源(KF176351)、牛源(KU904278)和羊源(KU904267)HEV毒株亲缘关系较近,核苷酸同源性分别为93.1%~98.3%、92.7%~97.9%和92.7%~97.9%。结论  山东省HEV优势流行株属于基因Ⅳ型4d亚型,跨种间传播可能是山东省人HEV感染的主要来源。
关键词 :肝炎病毒,戊型;基因型;分子流行病学;监测
Genotype distribution and molecular epidemiology of hepatitis E virus isolated in Shandong Province of China in 2017
YanBingyu,LyuJingjing,FengYi,WuWenlong,LiuJiaye,XuAiqiang,ZhangLi     
Division of Expanded Programme Immunization, Shandong Provincial Center for Disease Control and Prevention/Shandong Provincial Key Laboratory of Infectious Disease Control and Prevention, Jinan 250014, China
Corresponding author: Zhang Li, Email: zl9127@163.com
Abstract:Objective  To understand the genotype distribution and molecular epidemiological characteristics of hepatitis E virus (HEV) isolated in Shandong Province, 2017.Methods  The cases of hepatitis E who were reported to the National Notifiable Disease Reporting System (NNDRS) from January to December 2017 in Shandong Province were chosen as the subjects in the study. Epidemiological information and blood samples were collected from 1 045 participants. Both anti-HEV IgM and anti-HEV IgG were detected using ELISA method. Viral nucleic acids were extracted only from those of anti-HEV IgM positive samples. Nested reverse transcription-polymerase chain reaction was carried out to amplify 644 bp nucleotide sequences within HEV open reading frame (ORF) 2 region. The sample sequences together with reference sequences from GenBank were subjected to phylogenetic analysis.Results  In total, 638 (61.1%) cases were detected positive for anti-HEV IgM. The average age of male was (57.9±12.2) years, and the anti-HEV IgM positive rate was 61.5% (496/807). The average age of female was (58.1±15.0) years, and the anti-HEV IgM positive rate was 59.7% (142/238). A total of 163 HEV strains were detected, and the positive rate was 25.6% (163/638). The positive rate of the eastern, central and western region was 23.0% (71/309), 33.6% (72/214) and 17.4% (20/115), respectively. Phylogenetic tree and homology analysis indicated that all isolates belonged to genotype Ⅳ, clustering into four different subgenotype (4a, 4b, 4d and 4h). Subgenotype 4d was predominant, accounting for 85.9% (140 strains), followed by 4b (7.4%, 12 strains), 4a (3.7%, 6 strains) and 4h (3.1%, 5 strains). The 4a, 4b, and 4h subgenotype were mainly detected in the eastern region, accounting for 3/5, 11/12, and 4/6, respectively. The 4d subgenotype was mainly in the middle region, accounting for 50.0% (70/140). The homology analysis showed that the 163 sequences shared 82.7% to 100.0% nucleotide sequence identity with each other. The 140 sequences of HEV 4d strains showed high similarity with swine-origin HEV(KF176351), cattle-origin HEV(KU904278)and sheep-origin HEV(KU904267)isolated in Shandong Province, and the nucleotide homology was 93.1%-98.3%, 92.7%-97.9% and 92.7%-97.9%, respectively.Conclusion  HEV genotype Ⅳ(4d subgenotype) was dominant in Shandong province. A complicated interspecies transmission might be the main source of human HEV infection in Shandong Province, China.
Key words :Hepatitis E virus;Genotype;Molecular Epidemiology;Surveillance
全文

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)引起的以消化道传播为主的急性肝脏传染病,是中国乃至全球重要的公共卫生问题之一[1, 2]。HEV主要分为4个基因型,其中基因Ⅰ型和Ⅱ型仅感染人类,主要在发展中国家流行;基因Ⅲ型和Ⅳ型为人畜共患病,其中猪为主要宿主,且以散发为主,基因Ⅲ型广泛分布于世界各地,基因Ⅳ型主要分布于亚洲国家,尤其是中国和日本[1,3, 4]。既往Ⅰ型是中国HEV流行的主要基因型[5],而近年来我国HEV流行的基因型已发生变化,目前Ⅳ型已成为中国HEV流行的优势基因型[6, 7]。山东省自2015年7月开始建立戊型肝炎病例监测系统,对所有通过法定传染病报告系统(National Notifiable Disease Reporting System,NNDRS)报告的戊型肝炎病例进行调查和血样采集。为了解山东省戊型肝炎病例中HEV基因型别分布和进化特征,本研究对2017年监测样本进行了分子流行病学分析,现将结果报告如下。

对象与方法  

1.对象:  选取山东省2017年1—12月通过NNDRS报告的戊型肝炎病例为研究对象,共1 151例,由经过培训的山东省县级疾病预防控制中心(center for disease control and prevention,CDC)免疫规划专业人员对其进行个案调查,收集一般情况(性别、年龄和家庭住址等)、发病及就诊时间、医疗机构检测结果等信息;同时采集其血液样本3~5 ml,冷藏送至山东省CDC,再采用酶联免疫吸附试验方法,使用HEV-IgM和HEV-IgG抗体检测试剂盒进行复核检测。因HEV RNA主要存在于HEV-IgM抗体阳性人群中,故本研究仅选取经复核检测HEV-IgM抗体阳性的血清用于提取病毒RNA。

2.主要试剂和仪器:  (1)主要试剂:HEV-IgM和HEV-IgG抗体检测试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司;病毒RNA提取试剂盒(QIAamp viral RNA mini kit)购自德国Qiagen公司;AMV逆转录酶购自美国Promega公司;PCR反应试剂Ex-Taq DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、缓冲液购自宝生物工程(大连)有限公司。(2)主要仪器:普通PCR扩增仪购自美国ABI公司;电泳仪购自北京六一生物科技有限公司。

3.病毒RNA提取:  取140 μl病例血清样本,采用病毒RNA提取试剂盒,按照试剂盒说明书进行操作,收集终体积为50 μl的RNA提取液,并立即用于后续实验或保存于-70 ℃备用。

4.HEV RNA扩增和测序:  参考文献[8]中方法,合成HEV开放阅读框(open reading frame,ORF)2区域内特异性的1对内侧引物和1对外侧引物序列,引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。具体步骤为:首先采用AMV逆转录酶,于42 ℃、50 min,进行逆转录反应,获得病毒cDNA;然后采用巢式PCR(nested PCR,nPCR)方法扩增HEV核苷酸片段,先用外侧引物进行第一轮PCR反应,反应条件:94 ℃预变性120 s,94 ℃变性60 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸90 s,扩增45个循环,最后72 ℃延伸10 min;然后再用内侧引物进行第二轮扩增,反应条件94 ℃预变性120 s,94 ℃变性60 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸90 s,扩增35个循环,最后72 ℃,延伸10 min。第二轮PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,所有阳性产物送生工生物工程(上海)股份有限公司纯化和测序。

5.序列分析和系统进化树构建:  首先采用DNAstar软件包中的SeqMan软件对测序结果进行裁剪和编辑。PCR终产物序列长度为644 bp(基因组第5 678~6 321位,参考缅甸株M73218),其中用于序列分析的区段长度为540 bp(病毒基因组第5 765~6 304位)。再使用MegAlign软件进行核苷酸同源性分析,然后采用MEGA 7.0软件包,对本研究获得的病毒株和GenBank数据库下载的参考标准株核苷酸序列进行比对,并运用邻接法(neighbor-Joining,NJ),选择Kimura 2-parameter核苷酸替代模型,构建基因亲缘性关系树,计算Bootstrap值,检验进化树各分支置信度,共1 000次重复运算,当Bootstrap值>70时认为构建的进化树可靠。

6.地区分布:  山东省东部地区指青岛、烟台、潍坊、威海、日照5个市,中部地区指济南、淄博、东营、莱芜、临沂5个市,西部地区指枣庄、济宁、泰安、德州、聊城、滨州、菏泽7个市。

7.统计学分析:  采用Epidata 3.0软件对监测数据进行录入,采用Stata10.0软件进行统计学分析。研究对象年龄和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)符合正态分布,采用表示,采用方差分析比较不同亚型组间差异;采用Fisher确切概率法比较不同亚型组间性别和地区构成差异。双侧检验,检验水准α=0.05。

结果  

1.基本情况:  1 045例病例的血清样本经HEV-IgM复核检测,抗体阳性率为61.1%(638例);其中,男性阳性率为61.5%(496/807),年龄为(57.9±12.2)岁,女性阳性率为59.7%(142/238),年龄为(58.1±15.0)岁;山东省东、中、西部地区阳性率分别为59.7%(309/518)、70.9%(214/302)和51.1%(115/225)。638例HEV-IgM抗体阳性的病例中,共检出HEV毒株163株,检出率为25.6%;其中,男性检出127株,女性检出36株;山东省东、中和西部地区检出率分别为23.0%(71/309)、33.6%(72/214)和17.4%(20/115),详见表1。163株HEV核苷酸序列已提交GenBank,接受号为MN254804~MN254966。

表12017年山东省HEV RNA检测阳性数量及基因型分布特征[例(%)]

2.基因型分布情况:  163株核苷酸片段均属于基因Ⅳ型,以4d亚型为主,占85.9%(140株),其次为4b亚型(7.4%,12株),以及少量的4a和4h亚型,分别占3.7%(6株)和3.1%(5株)。4a、4b、4d和4h基因亚型组病例的年龄分别为(56.4±17.0)、(60.3±17.4)、(58.9±11.9)和(56.2±12.2)岁,差异无统计学意义(F=0.21,P=0.886);ALT值分别为(1 703.4±1 281.4)、(1 110.4±751.5)、(1 149.7±1 210.2)和(1 067.7±732.8)U/L,差异无统计学意义(F=0.38,P=0.771);不同亚型病例的地区构成差异有统计学意义(P<0.001),4a、4b和4h基因亚型组病例以东部为主,分别占3/5、11/12和4/6,4d基因亚型组以中部为主,占50.0%(70/140)。详见表1

3.同源性和遗传进化分析:  163株HEV中,核苷酸序列同源性为82.7%~100.0%,其中43对核苷酸序列完全相同。根据进化树分析结果,选择与不同物种分离的4种亚型HEV代表株进行同源性分析,结果显示,140株HEV 4d亚型毒株与山东省地区猪源(KF176351)、牛源(KU904278)和羊源(KU904267)HEV毒株亲缘关系较近,核苷酸同源性分别为93.1%~98.3%、92.7%~97.9%和92.7%~97.9%;其余分离的5株HEV 4a亚型毒株与上海(EU366959)和吉林(EF077630)猪源HEV毒株核苷酸同源性为90.1%~94.8%;12株HEV 4b亚型株与黑龙江(DQ279091)、广东(JX855794)和广西(EU676172)猪源HEV毒株核苷酸同源性为91.1%~97.4%;6株HEV 4h亚型毒株与武汉(GU18851)、新疆(GU119961)和云南(KJ155502)猪源HEV毒株核苷酸同源性为94.4%~98.3%。此外,如图1所示,山东省各市HEV病毒株随机分布于各个小分支中,并没有明显的地区集中趋势。

图12017年山东省HEV分离株ORF2区域核苷酸序列系统进化树
近年来,我国戊型肝炎散发病例呈逐渐上升态势[5,9, 10],开展戊型肝炎病原学监测对该病的防控十分重要。目前欧洲已建立了人类、动物、食品和外环境等各类来源的HEV分子监测网络[11],而我国尚未建立该类监测网络。本研究对2017年山东省人感染戊型肝炎病例进行分子流行病学监测,对阐明该地区HEV基因型分布、基因特征和遗传进化具有重要意义。
        本研究发现,山东省戊型肝炎病例的血清中HEV RNA的检出率略高于江苏(19.2%)[12],而低于上海(32.79%)[13]和东北地区(47.10%)[14],其差异可能与样本采集的时间和保存条件不同等因素有关。相关研究显示,本研究采用的HEV ORF2保守区的核苷酸片段,能代表HEV的全基因序列进行遗传进化分析[8]。同源性分析和进化树构建结果显示,山东省流行的HEV基因型相对单一,均为基因Ⅳ型,与我国多地的研究结果一致[12,15, 16, 17, 18]。基因亚型分析表明,山东省HEV的优势亚型为4d亚型,既往研究发现4a、4d和4h亚型是我国HEV最为常见的亚型[19],其中在中国北方地区以4a和4d亚型为主[17,20],与本研究结果一致。虽然不同地域基因Ⅳ型HEV优势亚型不尽相同,但既往有报道各亚型HEV的致病性和感染模式并没有明显差异[21]
        基因Ⅳ型HEV引起的戊型肝炎是一种人畜共患病,目前Ⅳ型HEV是否会发生人与人的传播还不清楚,HEV的主要传播宿主是猪[1,22]。本研究结果显示,山东省人源HEV的基因序列不仅与山东省猪源HEV存在高度同源性,与山东省既往检出的牛源和羊源HEV亦有很近的亲缘关系,提示山东省HEV感染可能存在复杂的跨物种传播链。很多国家已在食物链的每一步均证实发现了传染性的HEV[23, 24],但目前我国鲜有该类直接病毒学证据支持的报道[25],尚需进一步深入研究。本研究同源性分析发现,在获得的毒株中核苷酸序列完全相同的有43对,其序列间是否存在流行病学关联,是否能通过基因溯源的方式追踪HEV的来源,仍有待进一步探讨。
        山东省于2015年7月开始对全省戊型肝炎病例进行监测,由经过培训的县级CDC专业人员对NNDRS报告的戊型肝炎病例进行调查和标本采集,本研究样本来源于该监测体系,并对2017年当年报告的约55%的戊型肝炎病例进行了HEV RNA检测,获得的HEV基因序列分布于全省17个设区的市的15个市,具有良好的代表性,为今后追踪山东省HEV基因特征变化,追溯病毒传播途径等研究奠定了良好的基础。但本研究由于病例调查的流行病学信息不尽详实,难以进行有效的病毒来源分析。
        2011年我国成功研发上市的重组戊型肝炎疫苗采用的是基因Ⅰ型氨基酸片段[26],由于HEV仅有一个血清型,因此虽然Ⅳ型HEV为山东省当前优势流行株,但接种该型戊型肝炎疫苗仍可提供免疫保护。总之,本研究证实山东省人源HEV优势流行株属于基因Ⅳ型,4d亚型,且与猪源、牛源和羊源HEV存在较高的同源性,跨种间传播可能是山东省人HEV感染的主要来源,但病毒传播模式和机制等问题仍需进一步研究。

参考文献
1Pérez-GraciaMT, GarcíaM, SuayB, et al. Current Knowledge on Hepatitis E[J]. J Clin Transl Hepatol, 2015, 3(2):117-126. DOI: 10.14218/JCTH.2015.00009.
2陈直平. 戊型肝炎:尚未引起足够重视的传染病[J].中华预防医学杂志, 2014, 48(9):753-755. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.09.001.
3MengXJ. Zoonotic and foodborne transmission of hepatitis E virus[J]. Semin Liver Dis, 2013, 33(1):41-49. DOI: 10.1055/s-0033-1338113.
4NakanoT, TakahashiK, TakahashiM, et al. Investigating the origin and global dispersal history of hepatitis E virus genotype 4 using phylogeographical analysis[J]. Liver Int, 2016, 36(1):31-41. DOI: 10.1111/liv.12880.
5RenX, WuP, WangL, et al. Changing Epidemiology of Hepatitis A and Hepatitis E Viruses in China, 1990-2014[J]. Emerg Infect Dis, 2017, 23(2):276-279. DOI: 10.3201/2302.161095.
6KamarN, BendallR, Legrand-AbravanelF, et al. Hepatitis E[J]. Lancet, 2012, 379:2477-2488. DOI: 10.1016/S0140-6736(11)61849-7.
7LiuP, LiL, WangL, et al. Phylogenetic analysis of 626 hepatitis E virus (HEV) isolates from humans and animals in China (1986-2011) showing genotype diversity and zoonotic transmission[J]. Infect Genet Evol, 2012, 12(2):428-434. DOI: 10.1016/j.meegid.2012.01.017.
8李峰, 孟继鸿, 董晨, 等. 戊型肝炎病毒通用性PCR引物的设计及其基因分型的研究[J].病毒学报,2009, 25(1):9-16. DOI: 10.3321/j.issn:1000-8721.2009.01.002.
9刘振球, 左佳鹭, 严琼, 等. 我国2004—2014年戊型肝炎流行的时空特征及趋势分析[J].中华流行病学杂志,2017, 38(10):1380-1385. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2017.10.017.
10孙校金, 张国民, 郑徽, 等. 2004—2017年中国戊型肝炎流行特征分析[J].中华预防医学杂志,2019, 53(4):382-387.DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2019.04.010.
11MulderAC, KronemanA, FranzE, et al. HEVnet: a One Health, collaborative, interdisciplinary network and sequence data repository for enhanced hepatitis E virus molecular typing, characterisation and epidemiological investigations[J]. Euro Surveill, 2019, 24(10).DOI: 10.2807/1560-7917.ES.2019.24.10.1800407.
12TianH, FuX, LiW, et al. Genotype 4 Hepatitis E Virus Prevalent in Eastern China Shows Diverse Subtypes[J]. Hepat Mon, 2015, 15(6):e25367. DOI: 10.5812/hepatmon.25367v2.
13任宏, 李燕婷, 周欣, 等. 上海市1997—2012年戊型肝炎流行特征和基因分型研究[J].中华流行病学杂志,2013, 34(5):419-423. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2013.05.002.
14朱光泽, 屈勇刚, 李一权, 等. 东北地区戊型肝炎病毒基因特征分析[J].基因组学与应用生物学,2015, 34(10):2075-2083. DOI: 10.13417/j.gab.034.002075.
15李燕婷, 郑英杰, 任宏, 等. 上海地区基因Ⅳ型戊型肝炎病毒基因变异分析[J].中华预防医学杂志,2010, 44(7):665-668. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2010.07.021.
16TangWF, KongDG, WangYH, et al. Hepatitis E virus infection in Wuhan, Central China[J]. Arch Virol, 2019, 164(1):27-32. DOI: 10.1007/s00705-018-4036-y.
17DaiX, DongC, ZhouZ, et al. Hepatitis E virus genotype 4, Nanjing, China, 2001-2011[J]. Emerg Infect Dis, 2013, 19(9):1528-1530. DOI: 10.3201/eid1909.130013.
18夏玉刚, 胡安群, 陆一涵, 等. 安庆市人与猪群中戊型肝炎病毒的系统进化分析[J].中华预防医学杂志,2010, 44(10):888-892. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2010.10.010.
19刘敏, 李丽娟, 肖文. 中国戊型肝炎病毒基因型及其亚型的地理分布[J].中国人兽共患病学报,2016, 32(2):182-187. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.017.
20GengY, ZhaoC, FanJ, et al. Genotype analysis of hepatitis E virus from sporadic hepatitis E cases in northern China[J]. Infect Genet Evol, 2013, 20:413-417. DOI: 10.1016/j.meegid.2013.10.003.
21SridharS, LoSK, XingF, et al. Clinical characteristics and molecular epidemiology of hepatitis E in Shenzhen, China: a shift toward foodborne transmission of hepatitis E virus infection[J]. Emerg Microbes Infect, 2017, 6(12):e115. DOI: 10.1038/emi.2017.107.
22European Association for the Study of the Liver. Electronic address: easloffice@easloffice.eu, European Association for the Study of the Liver. EASL Clinical Practice Guidelines on hepatitis E virus infection[J]. J Hepatol, 2018, 68(6):1256-1271. DOI: 10.1016/j.jhep.2018.03.005.
23BertoA, MartelliF, GriersonS, et al. Hepatitis E virus in pork food chain, United Kingdom, 2009-2010[J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(8):1358-1360. DOI: 10.3201/eid1808.111647.
24ColsonP, BorentainP, QueyriauxB, et al. Pig liver sausage as a source of hepatitis E virus transmission to humans[J]. J Infect Dis, 2010, 202(6):825-834. DOI: 10.1086/655898.
25NanY, WuC, ZhaoQ, et al. Zoonotic Hepatitis E Virus: An Ignored Risk for Public Health[J]. Front Microbiol, 2017, 8:2396. DOI: 10.3389/fmicb.2017.02396.
26王晓娟, 王玲, 庄辉. 戊型肝炎疫苗研究最新进展[J].中华流行病学杂志,2011, 32(6):629-631. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2011.06.022.