中华预防医学杂志    2020年09期 血清GPC3水平在原发性肝细胞癌患者辅助诊断中的应用价值    PDF     文章点击量:129    
中华预防医学杂志2020年09期
中华医学会主办。
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汤笑禹 王砚春 卢仁泉 郭林
TangXiaoyu,WangYanchun,LuRenquan,GuoLin
血清GPC3水平在原发性肝细胞癌患者辅助诊断中的应用价值
The value of serum glypican-3 level in aided diagnosis of patients with primary hepatocellular carcinoma
中华预防医学杂志, 2020,54(9)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112150-20200515-00731
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投稿日期: 2020-05-15
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血清GPC3水平在原发性肝细胞癌患者辅助诊断中的应用价值
汤笑禹 王砚春 卢仁泉 郭林     
汤笑禹 复旦大学附属肿瘤医院检验科,上海 200032
王砚春 复旦大学上海医学院肿瘤学系 200032
卢仁泉 复旦大学附属肿瘤医院检验科,上海 200032
郭林 复旦大学附属肿瘤医院检验科,上海 200032
摘要: 目的  探讨血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)检测在原发性肝细胞癌(HCC)辅助诊断、疗效监测等方面的临床应用价值。方法  选择2018年3月至2019年5月在复旦大学附属肿瘤医院病理诊断为HCC的患者166例作为实验组,以同医院体检中心健康者94名、良性肝病患者50例分别作为健康对照组和良性对照组,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法和电化学发光法分别检测血清GPC3和甲胎蛋白(AFP)含量[中位数(四分位数Q1,Q3)],利用Logistic回归分析GPC3联合AFP等指标在HCC中的诊断准确性。结果  HCC患者组的血清GPC3含量为0.210(0.048,0.801)mg/L,明显高于健康对照组0.029(0.019,0.052)mg/L及良性对照组0.033(0.021,0.043)mg/L(Z=-7.69,P<0.001);谷草转氨酶(AST)(Z=-7.02)、谷丙转氨酶(ALT)(Z=-6.85)和AFP(Z=-8.36)在三组人群中均存在明显差异(P均<0.001);HCC患者的血清GPC3浓度与ALT(Z=-3.77)、AST(Z=-4.09)相关(P<0.001)。通过ROC曲线确定GPC3的Cut-off值0.077 mg/L后,血清GPC3联合AFP检测对HCC的灵敏度高达87.82%,特异性为77.86%,阳性预测值为82.53%,阴性预测值为84.29%。通过Logistic回归分析得到HCC-GPC3相关模型,其ROC曲线下面积为0.882,总灵敏度为91.10%,总特异性为72.73%。进一步分析,HCC患者的术后血清GPC3含量0.454(0.019,0.286)mg/L较术前0.608(0.039,0.554)mg/L明显降低(Z=-7.32,P<0.001)。结论  血清GPC3水平检测可应用于HCC的辅助诊断及疗效监测,联合GPC3及AFP可提高HCC的诊断效能。
关键词 :原发性肝细胞癌;磷脂酰肌醇蛋白聚糖3;甲胎蛋白;诊断
The value of serum glypican-3 level in aided diagnosis of patients with primary hepatocellular carcinoma
TangXiaoyu,WangYanchun,LuRenquan,GuoLin     
Department of Clinical Laboratory, Fudan University Shanghai Cancer Centre, Shanghai 200032, China
Corresponding author: Guo Lin, Email:guolin500@hotmail.com
Abstract:Objective  To investigate the clinical value of glypican-3 (GPC3) detection in the diagnosis and therapy-monitoring of primary hepatocellular carcinoma (HCC).Methods  From March 2018 to May 2019, the patients with HCC were enrolled as the experimental group(n=166)from Fudan University Shanghai Cancer Centre, while the specimens from health control group(n=94) and benign control group (n=50) were analyzed. The serum of GPC3 and alpha fetoprotein (AFP)levels were respectively detected by ELISA and chemiluminescence. GPC3 detections combined with AFP etc. in accuracy of HCC diagnosis were explored by using Logistic regression analysis.Results  The serum GPC3 level in patients with HCC [0.210 (0.048, 0.801)mg/L] [Median (quartile Q1, Q3)] was significantly higher than those in healthy controls [0.029(0.019, 0.052)mg/L] and benign controls [0.033(0.021, 0.043) mg/L] (Z=-7.69, P<0.001).The serum levels of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and AFP were significantly different among the three groups (Z=-7.02, -6.85, -8.36 respectively, P<0.001). Among the serological indicators, it was related to ALT and AST (Z=-3.77, -4.09 respectively, P<0.001).The Cut-off level of GPC3 was determined as 0.077 mg/L by ROC curve. The sensitivity of the combined detection of serum GPC3 with AFP for HCC was up to 87.82%, the specificity was 77.86%, the negative predictive value was 84.29%, and the positive predictive value was 82.53%.The HCC-GPC3 model was constructed by using Logistic regression analysis. The area under the ROC curve was 0.882, the total sensitivity was 91.10%, and the total specificity was 72.73%. Further analysis showed that the serum GPC3 of patients with HCC was significantly lower [0.454(0.019, 0.286) mg/L] than that before surgery[0.608(0.039, 0.554)mg/L](Z=-7.32, P<0.001).Conclusion  The detection of serum GPC3 can be applied to aid diagnosis and therapy-monitoring of HCC.The combination of GPC3 and AFP can improve the diagnostic efficiency of HCC.
Key words :Primary hepatocellular carcinoma;Glypican-3;Alpha fetoprotein;Diagnosis
全文

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,病死率位居第二,其恶性程度高,病情进展快1, 2。在我国原发性肝癌中肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)约占90%,患者早期无明显症状,一旦出现症状再确诊时,往往已属中晚期,耽误了治疗的最佳时机3, 4。因此,早期发现和诊断HCC对提高根治率、改善患者的预后具有极其重要的意义。目前,临床应用的肿瘤标志物甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)对HCC的诊断价值尤其是对于AFP表达阴性或AFP小于400 ng/ml的HCC患者的诊断特异性和灵敏度均不理想5
        磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)于1996年被Pilia等发现6。GPC3是具有重要作用的葡糖氨基聚糖蛋白,可与多种生长因子相结合,同时与多条复杂的信号通路息息相关7。GPC3是一种癌胚蛋白,作为HCC的肿瘤标志物是近年来的研究热点8, 9。GPC3在HCC中无论是mRNA水平还是蛋白水平均高表达,而在其他肿瘤及良性肝病中呈低表达或不表达,在AFP阴性的肝癌中亦有表达,对HCC的诊断具有较高的灵敏度和特异性,与HCC的预后亦有一定的关系10。测定血清GPC3含量对于HCC的辅助诊断及疗效监测有一定的临床价值11, 12, 13, 14。本研究对166例HCC患者、94名健康对照者及50例良性肝病患者的血清GPC3含量进行测定,探索其在临床应用中的价值。

对象与方法  

一、对象  共纳入HCC患者166例,患者年龄(57.28±12.09)岁,其中男性142例,女性24例,均为复旦大学附属肿瘤医院2018年3月至2019年5月经病理明确诊断的HCC患者15,其中Ⅰ~Ⅱ期72例,Ⅲ~Ⅳ期94例;单一病灶121例,多发病灶45例。健康对照者94名,年龄(51.04±13.28)岁,选取复旦大学附属肿瘤医院2019年5月至6月健康体检人群,无心、肝、肺及肾等重要疾病,肝肾功能正常且无家族肿瘤患病史。良性肝病组50例(肝硬化15例,慢性乙型肝炎35例),为复旦大学附属肿瘤医院2019年3月至6月体检人群。三组人群的年龄、性别等基本资料比较,差异无统计学意义(Z=0.55,P=0.582)。本研究通过复旦大学附属肿瘤医院伦理审查委员会审查(批号:050432-4-1212B),所有患者均由本人或家属签署知情同意书。

二、标本来源  选取新入院未经手术及放化疗的HCC患者、健康体检人群、良性肝病患者静脉采血3~4 mL,2 620×g离心10 min,取上层血清,立即检测或-80 ℃冻存,1周内检测。

三、GPC3测定原理及方法  血清GPC3的测定采用日本Fujirebio Diagnostics AB公司磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3酶联免疫检测试剂盒。使用生物素标记的抗Glypican-3F(ab′)2 单克隆片段,在包被有链霉亲和素的微孔中与校准品、质控品、患者样本一起温育。加入带有辣根过氧化物酶标记的抗GPC3单克隆抗体。在完成温育和清洗操作后,向各微孔中加入缓冲底物与显色试剂进行酶反应。显色强度与样品中的GPC3含量成比例。加入终止液后,通过微孔板分光光度计在450 nm处测定吸光度。

四、统计学分析  采用SPSS 22.0软件进行统计分析。血清学指标为非正态分布,以中位数(四分位间距Q1,Q3)[M(Q1, Q3)]表示,通过非参数检验比较三组人群的血清GPC3、AFP、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)等指标的差异,以P<0.05作为差异有统计学意义。采用Mann-Whitney U检验比较GPC3、AFP以及联合检测的灵敏度和特异性,利用Logistic回归分析,得到HCC-GPC3相关模型,绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线。

结  果  

一、三组人群血清GPC3浓度的比较  与健康对照组(health control,HC)血清GPC3浓度为0.029(0.019,0.052)mg/L和良性肝病组(benign control,BC)血清GPC3浓度为0.033(0.021,0.043)mg/L相比,HCC组血清GPC3浓度明显升高,达到0.210(0.048,0.801)mg/L;经非参数检验,差异有统计学意义(Z=-7.69,P<0.001)。

二、HCC临床特征与GPC3的相关性分析  检测三组人群的HCC相关指标,计算中位数及其四分位数,比较各组数据间是否存在差异(表1)。结果发现AST、ALT和AFP在三组人群中均存在明显差异。

表1研究人群的临床血清学特征
将HCC患者组按年龄、肿瘤分期及病灶个数及相关血清学指标进行分组,比较各亚组间血清GPC3浓度是否存在差异(表2),其中血清学指标的分组均通过各自的ROC曲线,分析求得Cut-off值,以此作为分组依据。结果发现HCC患者的血清GPC3浓度与血清学指标ALT、AST相关,但与患者年龄、肿瘤分期及病灶个数无关。
表 2HCC患者血清GPC3与临床特征的相关性分析

三、GPC3用于HCC的联合诊断  目前,未见文献报道中国人群GPC3的正常参考范围。以HCC组作为实验组,以健康人群与良性肝病组作为对照组进行分析,绘制ROC曲线,选择约登指数最大的切点为临界点,确定GPC3浓度0.077 mg/L为最佳临界值,此时对HCC诊断的灵敏度为59.03%,特异性为84.72%。
        根据ROC曲线计算出GPC3和AFP检测结果的诊断性能,分别用灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值表示,同时计算出GPC3、AFP联合诊断的结果(表3)。血清GPC3诊断HCC的灵敏度为59.03%,AFP灵敏度为57.83%,但其联合诊断的灵敏度为 87.82%,高于单一指标的应用。因此,GPC3联合AFP对于辅助诊断HCC具有一定的临床价值。

表3GPC3和AFP联合检测对HCC的诊断性能

四、HCC-GPC3相关模型分析综合上述对HCC诊断具有显著意义的指标进行联合分析,采用Logistic回归法,经拟合回归方程后计算HCC-GPC3相关模型的Score值,得到回归方程为:OcScore=-0.644+0.393*[lnAFP](U/L)+0.573*[lnGPC3](mg/L)+0.055*AST(U/L)+0.004*ALT(U/L)  绘制HCC-GPC3相关模型的ROC曲线,曲线下面积为0.882,得出联合的血清标志物Score值的Cut-off值为0.888,对HCC诊断的总灵敏度为91.10%,总特异性为72.73%。
        联合GPC3、AFP两种肿瘤标志物及AST、ALT两种肝功能指标共同辅助诊断HCC,可有效提高灵敏度,优化特异性。

五、GPC3浓度对HCC的疗效监测  对本研究166例HCC患者中的119例患者进行随访分析。收集患者术前及术后1周内的血清并检测GPC3,有111例(93.2%)患者术后血清GPC3浓度低于术前水平[术后0.454(0.019,0.286)mg/L,术前0.608(0.039,0.554)mg/L],患者术后病情好转(Z=-7.32,P<0.001)。本研究进一步发现,若术后血清GPC3的浓度较术前测定结果降低20%及以上,手术治疗效果较好;本研究中有89例患者手术治疗效果较好,测定其术后血清GPC3浓度均下降20%以上。

讨  论  目前,血清AFP仍是HCC辅助诊断的主要手段之一,但其灵敏度偏低,部分HCC患者AFP呈低水平或阴性16。因此,AFP需要联合其他标志物进行检测以增加灵敏度、降低漏诊率、提高HCC的诊断性能17, 18
        Sung等19发现GPC3蛋白在肝癌组织中的表达要高于正常和发生肝硬化的肝组织。Kwack等还发现,GPC3可以减少HCC细胞对Ⅰ型胶原和纤连蛋白的黏附,从而增强肿瘤细胞的迁移性和侵袭性20, 21。本研究发现,HCC患者的血清GPC3水平显著高于健康对照者及良性肝病患者(Z=-7.69,P<0.001)。本研究中70例(42.2%)HCC患者血清AFP 呈阴性,其中有42例血清GPC3异常升高。单独使用AFP检测的灵敏度较低(57.8%),而血清GPC3和AFP联合检测能够显著提高灵敏度(87.8%)。说明GPC3和AFP联合检测能够提高HCC的诊断性能。
        在慢性肝病中,一些肝功能指标如白蛋白,其水平能够一直保持正常直至HCC的发生21。本研究发现三组人群的血清GPC3、AFP、ALT和AST有显著差异(P均<0.001),进一步分析显示HCC患者的血清GPC3浓度与ALT、AST相关(P均<0.001)。AST和ALT作为较敏感的肝功能指标,易受到其他因素的影响,在肝癌的进展中其结果容易产生波动。在一些研究中,HCC组织中的GPC3蛋白表达量与病灶个数无关,但是与分期密切相关22, 23,这一点与本血清学研究中GPC3浓度与HCC分期无显著相关的结论有所出入,其原因可能是HCC组织中肿瘤细胞释放GPC3进入外周血较为缓慢;但是,从阳性率上看,本研究中的Ⅲ+Ⅳ期HCC患者血清GPC3阳性率(68/94,72.7%)远高于Ⅰ+Ⅱ期患者(37/72,52.4%),仍说明血清GPC3可以体现HCC的发生发展。
        本研究通过Logistic回归构建HCC-GPC3相关模型,计算相关模型的Score值,得到回归方程。其ROC曲线下面积达到0.882,检测灵敏度达到91.10%。HCC-GPC3相关模型能够根据危险因素得出Score值预测HCC发生的概率,对HCC的辅助诊断具有重要临床意义。
        目前用于HCC疗效监测的指标仍局限于AFP。但是,某些疗效较差并存在肿瘤复发的患者AFP呈阴性24, 25, 26。本研究检测了119例HCC患者术前及术后1周的血清GPC3浓度,发现血清GPC3浓度显著下降(Z=-7.32,P<0.001),患者术后病情好转,说明血清GPC3检测能够应用于判断患者手术治疗是否有效。提示GPC3联合AFP能够更好地对HCC患者进行疗效监测27
        本研究的局限性在于样本例数不够大,需要通过增加样本量来矫正HCC-GPC3模型的回归系数,使其更精准地辅助诊断HCC。目前,缺少血清GPC3在HCC患者随访中价值以及HCC患者进行化疗后血清GPC3改变的相关研究。本研究随访时间不够长,未来的研究应增加血清GPC3在HCC患者随访中的应用。有理由相信GPC3是一种在HCC辅助诊断中具有很好前景的标志物。

参考文献
1汤钊猷. 从生物学角度看肝癌[J]. 医学研究杂志, 2008, 37(1):1-3.DOI:10.3969/j.issn.1673-548X.2008.01.001.
2JemalA, SiegelR, XuJ, et al. Cancer statistics, 2010[J]. CA Cancer J Clin, 2010, 60(5):277-300.DOI:10.3322/caac.20073.
3曾红梅,曹毛毛,郑荣寿,等. 2000—2014年中国肿瘤登记地区肝癌发病年龄变化趋势分析[J]. 中华预防医学杂志, 2018, 52(6):573-578.DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2018.06.004.
4中华预防医学会肿瘤预防与控制专业委员会感染相关肿瘤防控学组,中华预防医学会慢病预防与控制分会,中华预防医学会健康传播分会. 中国肝癌一级预防专家共识(2018)[J]. 中华预防医学杂志, 2019, 53(1):36-44.DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2018.07.013.
5HuB, TianX, SunJ, et al. Evaluation of individual and combined applications of serum biomarkers for diagnosis of hepatocellular carcinoma: a meta-analysis[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(12):23559-23580.DOI:10.3390/ijms141223559.
6PiliaG, Hughes-BenzieR M, MacKenzieA, et al. Mutations in GPC3, a glypican gene, cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth syndrome[J]. Nat Genet, 1996, 12(3):241-247. DOI:10.1038/ng0396-241.
7FicoA, MainaF, DonoR. Fine-tuning of cell signaling by glypicans[J]. Cell Mol Life Sci, 2011, 68(6):923-929. DOI:10.1007/s00018-007-7471-6.
8ShirakawaH, KuronumaT, NishimuraY, et al. Glypican-3 is a useful diagnostic marker for a component of hepatocellular carcinoma in human liver cancer[J].Int J Oncol, 2009, 34(3):649-656. DOI:10.3892/ijo_00000190.
9WangHL, AnatelliF, ZhaiQJ, et al. Glypican-3 as a useful diagnostic marker that distinguishes hepatocellular carcinoma from benign hepatocellular mass lesions[J]. Arch Pathol Lab Med, 2008, 132(11):1723-1728. DOI:10.1043/1543-2165-132.11.1723.
10NakatsuraT, YoshitakeY, SenjuS, et al. Glypican-3, overexpressed specifically in human hepatocellular carcinoma, is a novel tumor marker[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 306(1):16-25. DOI:10.1016/s0006-291x(03)00908-2.
11ToretskyJA, ZitomerskyNL, EskenaziAE, et al. Glypican-3 expression in Wilms tumor and hepatoblastoma[J]. J Pediatr Hematol Oncol, 2001, 23(8):496-499. DOI:10.1097/00043426-200111000-00006.
12SaikaliZ, SinnettD. Expression of glypican 3 (GPC3) in embryonal tumors[J]. Int J Cancer, 2000, 89(5):418-422.
13CapurroM, WanlessIR, ShermanM, et al. Glypican-3: a novel serum and histochemical marker for hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 2003, 125(1):89-97. DOI:10.1016/s0016-5085(03)00689-9.
14ShirakawaH, SuzukiH, ShimomuraM, et al. Glypican-3 expression is correlated with poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Sci, 2009, 100(8):1403-1407. DOI:10.1111/j.1349-7006.2009.01206.x.
15AyusoC, RimolaJ, VilanaR, et al. Diagnosis and staging of hepatocellular carcinoma (HCC): current guidelines[J]. Eur J Radiol, 2018, 101:72-81. DOI:10.1016/j.ejrad.2018.01.025.
16李嘉妍. AFP、C A 1 9 -9 、CEA联合检测对原发性肝癌的早期诊断价值[J]. 临床肝胆病杂志, 2017,33(7):1291-1295. DOI:10.3969/j.issn.1001-5256.2017.07.017.
17El-SaadanyS, El-DemerdashT, HelmyA, et al. Diagnostic Value of Glypican-3 for Hepatocellular Carcinomas[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2018, 19(3):811-817.DOI:10.22034/APJCP.2018.19.3.811.
18ShuH, LiW, ShangS, et al. Diagnosis of AFP-negative early-stage hepatocellular carcinoma using Fuc-PON1[J]. Discov Med, 2017, 23(126):163-168.
19SungYK, HwangSY, ParkMK, et al. Glypican-3 is overexpressed in human hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Sci, 2003, 94(3):259-262. DOI:10.1111/j.1349-7006.2003.tb01430.x.
20StiglianoI, PuricelliL, FilmusJ, et al. Glypican-3 regulates migration, adhesion and actin cytoskeleton organization in mammary tumor cells through Wnt signaling modulation[J]. Breast Cancer Res Treat, 2009, 114(2):251-262. DOI:10.1007/s10549-008-0009-2.
21TorisuY, WatanabeA, NonakaA, et al. Human homolog of NOTUM, overexpressed in hepatocellular carcinoma, is regulated transcriptionally by beta-catenin/TCF[J]. Cancer Sci, 2008, 99(6):1139-1146. DOI:10.1111/j.1349-7006.2008.00814.x.
22MiuraM, FujinamiN, ShimizuY, et al. Usefulness of plasma full-length glypican-3 as a predictive marker of hepatocellular carcinoma recurrence after radial surgery[J]. OncolLett, 2020, 19(4):2657-2666. DOI:10.3892/ol.2020.11371.
23NingS, BinC, NaH, et al. Glypican-3, a novel prognostic marker of hepatocellular cancer, is related with postoperative metastasis and recurrence in hepatocellular cancer patients[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(1):351-357. DOI:10.1007/s11033-011-0745-y.
24安松林,王黎明,荣维淇,等. 原发性肝细胞癌术前血清AFP的预后价值及与临床病理因素相关性分析[J]. 中华普通外科杂志, 2015, 30(3):189-193.DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-631X.2015.03.004.
25杨针,汪建林,尚润泽,等. 术前血清甲胎蛋白水平与肝细胞癌术后患者早期复发的相关性分析[J]. 中华肝胆外科杂志, 2018, 24(3):179-183. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-8118.2018.03.010.
26AttallahAM, El-FarM, AbdelMC, et al. Evaluation of cytokeratin-1 in the diagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. Clin Chim Acta, 2011, 412(23-24):2310-2315. DOI:10.1016/j.cca.2011.08.029.
27冯军花,刘志权,魏媛媛,等. 血清 GPC3与 TGF-β1联合检测对 AFP 阴性原发性肝癌的诊断价值[J]. 国际检验医学杂志, 2015,36(19):2787-2788. DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.19.005.