中华预防医学杂志    2021年01期 2018年烟台市同期五起伤寒病原学研究及溯源分析    PDF     文章点击量:783    
中华预防医学杂志2021年01期
中华医学会主办。
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宫月华 朱董楠 王彦青 李燕 宋燕 邹晓楠 刘文娟 徐迎春
GongYuehua,ZhuDongnan,WangYanqing,LiYan,SongYan,ZouXiaonan,LiuWenjuan,XuYingchun
2018年烟台市同期五起伤寒病原学研究及溯源分析
Etiological survey and traceability analysis of five cases of typhoid fever during the same period in Yantai city
中华预防医学杂志, 2021,55(1)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112150-20200624-00922
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投稿日期: 2020-06-24
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2018年烟台市同期五起伤寒病原学研究及溯源分析
宫月华 朱董楠 王彦青 李燕 宋燕 邹晓楠 刘文娟 徐迎春     
宫月华
朱董楠
王彦青
李燕
宋燕
邹晓楠
刘文娟
徐迎春
摘要: 目的  分析烟台市5起伤寒病原学特征及分子流行病学关联。方法  2018年自烟台市5例伤寒确诊病例样本和流行病调查样本分离获得6株伤寒沙门菌菌株,病例发病时间自2018年5月26日至7月24日,分别分布于烟台牟平区水道镇、烟台蓬莱区登州街道、烟台龙口东莱街道、烟台牟平区文化街道、烟台芝罘区福莱山街道。采用常规细菌分离方法和XbaⅠ/BlnⅠ双酶切脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对伤寒杆菌进行溯源分析,同时开展viaB毒力基因检测和27种临床常用抗生素敏感试验对伤寒杆菌进行病原学研究。结果  6株伤寒杆菌经PFGE-XbaⅠ和PFGE-BlnⅠ电泳分为4个PFGE模式,其中3株菌同源性100%;1株多耐药菌(外籍患者),1株单耐药菌(外省滞留史患者),1株完全敏感菌,同一PFGE模式的3株菌药敏表型一致,除对氨基糖甙类和喹诺酮类部分抗生素中介外,对其他抗生素均敏感; 除外籍患者标本分离株viaB基因阴性外,其他菌viaB基因均阳性。结论  烟台寒杆菌对临床常用抗生素敏感性良好,仍需重视伤寒散发病例发生和伤寒输入感染。
关键词 :伤寒;电泳, 凝胶, 脉冲场;病原
Etiological survey and traceability analysis of five cases of typhoid fever during the same period in Yantai city
GongYuehua,ZhuDongnan,WangYanqing,LiYan,SongYan,ZouXiaonan,LiuWenjuan,XuYingchun     

Corresponding author: Xu Yingchun, Email: ytcdcjh@163.com
Abstract:Objective  To analyze the etiological characteristics and molecular epidemiological correlation of five cases of typhoid fever during the same period in yantai city.Methods  Six S. Typhis strains were isolated from 5 typhoid patients and epidemiological samples in Yantai city in 2018. The onset time of the cases were from May 26, 2018 to July 24, 2018, distributed in Shuidao Town of Muping District, Dengzhou Street of Penglai District, Donglai Street of Longkou District, Wenhua Street of Muping District and Fulaishan Street of zhifu District. S. Typhis strains were analyzed by conventional bacterial isolation method and XbaⅠ/BlnⅠ double-enzyme digestion pulse-field gel electrophoresis (PFGE). Meanwhile, ViaB virulence gene detection and 27 common antibiotics sensitivity tests were conducted to study the etiology of S. Typhis.Results  Six strains of S. Typhi were isolated from 5 patients and the domestic egg of one patient, which were divided into 4 PFGE patterns by PFGE-XbaⅠ and PFGE-BlnⅠ and among which 3 strains had the same PFGE patterns.One multi-drug resistant strain (foreign patient), one single-drug resistant strain (patient with a history of provincial retention), and one completely sensitive strain were detected. The three strains of the same PFGE pattern exhibit the same drug-sensitive phenotype which were intermediate against aminoglycosides and quinolones and susceptibility against the other antibiotics.All of the strains carried the ViaB virulence factor except the strain from the foreign patient.Conclusion  Local S. Typhi is susceptibility or intermediate against antibiotics commonly used in clinic.Sporadic cases of typhoid fever and typhoid imported infections still need attention.
Key words :Typhoid fever;Electrophoresis, gel, pulsed-field;Noxae
全文

伤寒系由伤寒杆菌引起的可危及生命的感染,常见并发症有中毒性肝炎、中毒性心肌炎、胆囊炎等,严重者可并发肠出血、肠穿孔、伤寒性脑病1, 2。2018年WHO公布全球伤寒病例数为每年1 100万~2 000万,约导致12.8万~16.1万例死亡。山东虽为伤寒低流行省份,但周边临省伤寒发病率均居高不下3, 4, 5,且烟台为旅游城市,人口流动频繁,仍需警惕跨地区传播和聚集性疫情的发生。近 5 年来,烟台市伤寒维持在较低发病水平,偶有散发病例出现。本研究对烟台市同期5起伤寒疫情分离菌株进行药敏分析,并采用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)技术对分离株进行分子分型,分析不同来源菌株之间的相关性,为全面掌握烟台市伤寒杆菌分子流行病学特点,合理指导临床用药,预防控制伤寒提供科学依据。

材料与方法  1.菌株:6株伤寒沙门菌菌株分离自5例伤寒患者样本和流行病调查样本,病例发病时间从2018年5月26日至2018年7月24日,分别分布于烟台牟平区水道镇、烟台蓬莱区登州街道、烟台龙口东莱街道、烟台牟平区文化街道、烟台芝罘区福莱山街道。详见表1

表12018年烟台市5例伤寒病例基本信息
2.样本采集:无菌采集5例患者粪便样本或血液样本,并根据流行病调查信息无菌采集可疑食物、饮用水,可疑环境样本及患者密切接触者粪便样本。详见表2
表22018年烟台市5起伤寒疫情样本采集基本信息
3.主要仪器与试剂:(1)试剂:沙门菌诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司;肠杆菌科细菌鉴定系统 API20E购自法国梅里埃公司;SeaKem? Gold Agar购自美国Lonza公司;限制性内切酶 XbaⅠ、限制性内切酶BlnⅠ、Premix TaqT购自日本Takara公司;蛋白酶K购自美国MERCK公司;QX DNA Size Marker50-800bp、QX AlignmentMarker15bp/1kb购自北京卓诚惠生物科技股份有限公司;ViaB引物购自上海生工生物公司;革兰阴性需氧菌药敏检测板购自上海星佰生物公司。(2)仪器:CHEFMAPPER脉冲场凝胶电泳仪、GelDocTMXR+凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司;PCR扩增仪购自杭州博日科技有限公司;全自动核酸蛋白纯化仪购自德国QIAxcel公司。
        4.菌株的分离鉴定:粪便和血液及涂抹物标本、食品和水、饲料分别参照WS280-2008《伤寒和副伤寒诊断标准》6、GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》7、GB/T13091-2018《饲料中沙门菌的测定》8鉴定和分型,血清凝集试验设生理盐水对照。
        5.PFGE溯源:分型按照Pulse NetChina网络实验室公布的沙门菌PFGE标准分型方法,沙门菌标准株H9812作为分子质量标记。将伤寒杆菌DNA经XbaⅠ、BlnⅠ酶切后进行PFGE,电泳图谱录入国家致病菌识别网信息系统构建聚类树,进行相似度分析。
        6.药物敏感性测定:运用国家致病菌识别网肠道菌专用革兰阴性需氧菌药敏检测板检测菌株对27种药物敏感性,以大肠埃希菌ATCC25922作为药敏质控菌株,肉眼判读结果,得到 MIC 值,并根据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的相应标准获得相应敏感、中度和耐药结果。
        7.viaB基因检测:viaB引物合成参考Hirose等9报道的序列,上游引物5′-GTT ATT TCA GCA TAA GGA G-3′,下游引物5′-CTT CCA TAC CAC TTT CCG-3′,产物长度为439 bp,循环参数为94 ℃ 5 min 1个循环;95 ℃ 30 s,55 ℃ 60 s,72 ℃ 90 s,25个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃ 结束反应,扩增产物进行电泳。扩增产物由山东一点基因科技有限公司进行测序。

结果  1.伤寒沙门菌的病原学检测5位患者标本及A患者自家养鸡蛋涂抹物共分离到6株沙门菌,分别标记a、b、c、d、e、a-1,经API20E生化鉴定系统鉴定为伤寒杆菌,除e血清型为O9,12:Hd外,其他菌株均为O9,12,Vi:Hd型。
        2.PFGE分析:6株菌DNA经XbaⅠ和BlnⅠ酶切电泳后,均得到清晰的PFGE图谱。聚类分析显示6株菌经XbaⅠ和BlnⅠ酶切图谱均分4个模式,a、a-1和b两种酶切电泳模式均一致。详见图12

图12018年烟台市6株伤寒杆菌脉冲场凝胶电泳XbaⅠ酶切图谱聚类分析
图22018年烟台市6株伤寒杆菌脉冲场凝胶电泳BlnⅠ酶切图谱聚类分析
3.伤寒沙门菌分离株的药敏测定:a、a-1和b均对链霉素、左氧沙星、环丙沙星中介,对其他药物均敏感;c对亚胺培南耐药,对链霉素和环丙沙星中介,对其他药物均敏感;d对所有药物均敏感;e对链霉素、萘啶酸、多黏菌素E耐药,对头孢唑林、米诺环素、左氧沙星、环丙沙星中介,对其他药物敏感。详见图3
图32018年烟台市6株伤寒杆菌27种临床常用抗生素敏感试验结果
4.伤寒沙门菌分离株viaB基因检测及测序结果:a、a-1、b、c、d 5株菌均在约439 bp处出现明显条带。5株菌viaB基因核酸序列比对结果见图4
图42018年烟台市5株伤寒杆菌(a、a-1、b、c、d)viaB基因核酸序列比对结果

讨论  PFGE为细菌分子分型“金标准”10,被广泛用于细菌分子流行病研究,协助追踪传染源11, 12, 13, 14。6株菌XbaⅠ、BlnⅠ电泳图谱均为4个模式,符合我国伤寒PFGE带型多而分散的特点15。a、a-1双酶切模式及viaB序列均一致,A为慢性腹泻患者,人是伤寒唯一宿主16,经粪口传播,判断A排菌污染鸡蛋的可能较大。国外曾有因带菌者污染致伤寒暴发的报道17。1%~4%急性伤寒患者会转为带菌者,持续排菌超3个月18,研究发现摄入105个伤寒杆菌可致伤寒19,防控伤寒应全面查治带菌者20。据调查资料判断,B因直接食用冷藏食品感染伤寒的可能较大。我国近1/3伤寒暴发为食源性暴发21。Vollaard等22认为个人卫生差、不良饮食习惯等可能是导致伤寒的主要原因。a、b的viaB序列存单点突变,不排除自发突变,且a、b检出时间间隔较短约1周(伤寒潜伏期为3~42 d23),a、b可能源于同一菌株,但现有资料无法证明A、B存在流行病学关联,不排除调查不充分的可能,也不排除a、b为本地流行株的可能。viaB基因无XbaⅠ和BlnⅠ酶切位点,故该突变未致PFGE模式改变。c、d、e的PFGE模式各不相同,根据Tenover等24对PFGE模式的解释判断三者亲缘性较远,据调查资料判断D因在外就餐摄入不洁食物而致伤寒,伤寒潜伏期为3~42 d,C、E不排除输入感染。与山东临省、非洲、南亚、东南亚等地25的人口流动应加强伤寒筛查,警惕输入感染。
        同一PFGE模式的3株菌药敏表型一致。据调查资料判断为本地菌株的4株菌(a、a-1、b、d)未见耐药现象,提示二、三代头孢菌素类药物仍可作为伤寒治疗常用药,需警惕伤寒治疗首选药喹诺酮类药物的耐药趋势。该发现与Zellweger等26的发现一致,不同的是本研究发现本地菌株对萘啶酸(一代喹诺酮)敏感,对环丙沙星和左氧沙星(三代喹诺酮)中介,可能与停用萘啶酸后,选择压力去除致耐药基因丢失有关。Zellweger等26还强调有必要审查当前肠热病治疗方案,建议将单药氟喹诺酮治疗改为大环内酯类或头孢菌素类和已恢复疗效的一线抗菌素的联合治疗。烟台菌株对氨苄西林、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶等临床伤寒治疗常用药均敏感,可作为本地伤寒治疗经验选药。PCR结果显示,伤寒杆菌普遍携带viaB基因。viaB基因为伤寒杆菌特异性基因27,vi阳性菌比阴性菌更具毒性28。e无viaB基因,不能编码荚膜多糖,故vi血清检测阴性,而患者E病情严重,e的致病机制有待进一步研究。
        本研究样本量较少,不足以全面反应烟台伤寒病原学特点。值得注意的是5起伤寒仅1起从调查样品中获得病原,提示我们应加强流行病学调查和实验室诊断能力。

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