中华预防医学杂志    2021年01期 过敏原检测方法的研究进展    PDF     文章点击量:761    
中华预防医学杂志2021年01期
中华医学会主办。
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毛杰 卢晴晴 曾辛 李萍 石盛洁 李菁 朱镇华 谢小兵 陆群
MaoJie,LuQingqing,ZengXin,LiPing,ShiShengjie,LiJing,ZhuZhenhua,XieXiaobing,LuQun
过敏原检测方法的研究进展
Progress in research of allergen detection methods
中华预防医学杂志, 2021,55(1)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112150-20200716-01019
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投稿日期: 2020-07-16
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过敏原检测方法的研究进展
毛杰 卢晴晴 曾辛 李萍 石盛洁 李菁 朱镇华 谢小兵 陆群     
毛杰 1
卢晴晴 1
曾辛 2
李萍 3
石盛洁 1
李菁 1
朱镇华 3
谢小兵 3
陆群 4
摘要: 随着全球环境变化,饮食与生活习惯和结构改变,各种食品添加剂的广泛使用,室内装修材料的更迭换代,由此引发的各种过敏性疾病逐年增加,给患者家庭和个人造成了严重的伤害。过敏性疾病的病因复杂多样,医学实验室常较难明确过敏原种类,给临床治疗和疾病预防及控制造成很多困扰。为了明确过敏原种类并及时避免与之接触,去除病因,除了询问病史、观察临床表现外,过敏原检测成为辅助诊断过敏性疾病的重要手段。
关键词 :变态反应;过敏原诊断;体外检测
Progress in research of allergen detection methods
MaoJie,LuQingqing,ZengXin,LiPing,ShiShengjie,LiJing,ZhuZhenhua,XieXiaobing,LuQun     

Corresponding author: Lu Qun,Email:luqun0718@163.com
Abstract:Allergic diseases have continued to increase year by year causing serious physical and mental injury to patients, families and individuals. This increase has been driven by conventional environmental and nutritional changes but is also created by the continual introduction of food additives into the diet and novel interior decoration materials into the living space. The causes of allergic diseases are complex and diverse, and the medical laboratory often is not be able to identify the allergic trigger; this creates a difficult environment to identify the appropriate clinical treatment for disease prevention and control. Physicians must be able to identify these triggers to help patients avoid the underlying allergenic cause of their disease. This can only be done by actively knowing a patient′s medical history, identifying the clinical manifestations of hypersensitivity and utilizing confirmatory testing as an important clinical tool in identifying the allergic source.
Key words :Allergen;Allergen diagnosis;in vitro testing
全文

近年来,随着环境变化和饮食结构的改变,以及食品添加剂的广泛使用,过敏性疾病的发生有逐年增加之势。过敏性疾病又称变态反应性疾病,轻者引发皮肤瘙痒、鼻炎、腹泻等,严重者引起呼吸困难甚至死亡。引起过敏性疾病的过敏原种类繁多,检测方法多样,优劣势及适应范围也不同,本文就过敏原种类、过敏原各种检测方法进行系统阐述。

一、概述  机体被某种抗原刺激并致敏后,再次受到同一抗原刺激时,敏感性较第一次高或反应性较第一次强,最终引起组织细胞损伤和/或生理功能紊乱等,这种异常免疫反应即为超敏反应,又称变态反应1。按照其发生的机制、速度和临床特征等,将超敏反应划分为四型:Ⅰ型即速发型过敏反应;Ⅱ型即细胞溶解型或细胞毒型超敏反应;Ⅲ型即免疫复合物型超敏反应;Ⅳ型即迟发型超敏反应。临床上急性过敏反应主要由Ⅰ型引起,其他变态反应性疾病以Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型居多。
        速发型过敏反应是较常见的过敏性疾病,其主要类型有皮肤、呼吸道、消化道过敏反应及过敏性休克等,处理不及时可能会危及生命。对过敏性疾病的防治方法有避免接触过敏原、脱敏治疗和激素治疗等,这些方法都要求明确过敏原种类,因此,及早进行实验室过敏原检测,对早期诊断、治疗和预防十分重要。
        过敏原种类繁多,最常见的是食入性过敏原和吸入性过敏原,其次为接触性过敏原和输注性过敏原(药物)。食入性过敏原2, 3包括牛奶、鸡蛋、鱼类、贝类和坚果等,吸入性过敏原有尘螨、屋尘、花粉、猫狗毛皮屑、真菌等4。临床上检测过敏原的方法众多:体内检测方法主要有皮肤点刺试验、皮内试验和过敏原激发试验(allergen provocation test),体内检测是诊断过敏性疾病的金标准,但体内试验风险较大,因此临床上未能广泛使用。临床上常规使用体外检测方法有酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫印迹法(immunoblotting test, IBT)、放射过敏原吸附法(radioallergosorbent test, RAST),磁微粒化学发光酶免疫分析技术(chemiluminescence microparticle immunoassay, CMIA)。
        此外还有一些技术,如固相免疫过敏芯片技术(immuno solid-phase allergy chip, ISAC)、液滴数字PCR技术(droplet digital PCR, ddPCR)、微阵列酶联免疫荧光法(enzyme-linked fluoroimmunoassay, ELFA)、纳米技术(nanotechnologies)、循环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification technologies,LAMPT)等也逐步得到发展与应用。
        这些体外试验大多检测过敏患者血清特异性抗体IgE(specific antibody immunoglobulin E,sIgE)来明确过敏原种类,具有较高的敏感性和较强的特异性4。血清总IgE(tIgE)是针对各种抗原的IgE总和,与遗传有关,并受年龄因素影响。tIgE的高低可反映患者是否为过敏体质,但tIgE升高也见于寄生虫感染和免疫疾病等,故不能仅依据tIgE升高来诊断过敏性疾病,应该结合临床症状以及sIgE检测结果综合判断。

二、过敏原检测方法  

(一)体内检测方法  1.皮肤点刺试验:皮肤点刺试验也称挑刺试验,是目前公认的过敏原体内检测方法5,能有效地测定过敏性皮肤病的特应性(对一种或多种过敏原敏感)。当某种过敏原进入对其有速发型过敏反应的患者皮肤时,其皮肤内的肥大细胞脱颗粒并释放会导致局部毛细血管扩张(红斑)、通透性增强(风团、水肿)的活性物质,如组胺等。试验时变应原点刺液为实验组,组胺为阳性对照组,生理盐水为阴性对照组,采用组胺作阳性对照计算相应的反应强度[结果评价: 皮肤指数(skin index,SI) = 变应原直径/组胺直径],阳性结果为局部皮肤出现红斑、红晕、风团甚至瘙痒。由于创伤性大,皮肤点刺试验在儿童、老人的过敏原检测中不大适用6。其优点7, 8, 9是设备要求低,操作简单,限制因素少,价格低廉,较为安全,灵敏性和特异性较高,假阳性较皮内试验少,且可根据临床需要在使用过程中随意变换各种过敏原;其缺点为对工作人员操作技术要求较高,敏感性较皮内试验低,结果受皮肤状况、药物及主观因素影响较大, 此外,尽管该方法是临床上筛查过敏原的重要方式之一,但适合的过敏原种类较少,难以满足临床过敏原检测需求10
        2. 皮内试验:皮内肥大细胞在其表面的特异性IgE与过敏原结合后会释放组胺等介质,局部出现风团或丘疹等荨麻疹样变态反应。皮肤消毒后,用注射器将0.01~0.02 ml尘螨、花粉、动物皮屑、食物、青霉素或血清等过敏原提取液注入皮内,使皮肤形成直径为2~3 mm的皮丘,注射后15~25 min内观察结果。通过皮内试验寻找过敏原,避免再次接触是最佳防治手段。但自然界中可引起过敏的物质很多,能被用于皮内试验的过敏原数量有限,因此,该法应用范围相应受限。
        3. 过敏原激发试验:激发试验主要用于Ⅰ型和Ⅳ型超敏反应,它是指在医疗设备监控下,模拟自然发病条件,从相对安全的小剂量开始逐渐增加过敏原剂量,观察有无过敏反应的发生,再现过敏反应发生的过程,从而验证引发过敏反应的过敏原种类。此法可用于排除皮肤试验中的假阳性反应和假阴性反应。激发试验根据其原理分为特异性和非特异两种:特异性激发直接使用抗原,对明确过敏原有一定价值;非特异性激发则是让患者吸入雾化后的甲基胆碱或组胺并观察患者对Ⅰ型变态反应的敏感性,从而对患者病因进行分析,或者对药物疗效进行判定。激发试验根据患者发病部位的不同,又可以分为结膜激发试验、鼻激发试验和支气管激发试验(bronchial provocation test, BPT)等。口服食物激发试验标准化流程专家共识11指出应根据患者的病史及过敏原检测结果选择可能致敏的食物。且食物的生熟、烹饪方法、相混合的食物可能会影响试验结果,因此需要进行试验前评估,并预估严重过敏反应的风险,准备抢救设备及药品。

(二)过敏原体外检测方法  血清学过敏反应的体外特异性诊断包括检测总IgE以及过敏原及过敏原特异性IgE(sIgE)。
        血清总IgE 由非特异性IgE和特异性IgE(sIgE)两部分组成。血清总IgE水平增高仅能提示Ⅰ型过敏反应的可能性大,但不能用于确诊过敏性疾病。除过敏性疾病之外,(1)免疫性疾病,(2)寄生虫和微生物感染等,(3)肿瘤疾病,(4)其他如输血、川崎病、肝脏疾病等,也可导致血清总IgE水平显著升高。而且,也有过敏性疾病患者总IgE正常的情况。因此,总IgE检测结果升高不能确诊,总IgE正常不能排除变态反应疾病,总IgE的临床意义是有限的,在临床实践中,需结合患者的病史以及临床症状来综合评估12
        Ⅰ型即速发型变态反应疾病患者的血清中含有针对其致敏变应原的特异性IgE抗体,即sIgE。目前体外特异性过敏原sIgE检测在变态反应疾病的诊断中占有越来越重要地位,现已被广泛使用,sIgE水平越高,与过敏疾病的相关性越强13
        体外检测sIgE 方法经过了几十年的发展,主要有以下一些方法。
        1.ELISA法:酶联免疫法 ELISA法14是食品工业中最常用的过敏原检测方法。96孔酶标微孔板技术在临床免疫领域被广泛使用,目前手工、半自动、全自动操作都有开展。配合全自动酶免疫仪可实现从样本稀释、加样、温育、清洗、结果判读和报告生成等全程实现自动化操作的过敏原检测系统。ELISA检测方法结果分定量和半定量体系,定量方法在实验结果准确性和重复性方面有较明显的优势,临床上采用定量方法检测过敏原含量能更好监测过敏反应程度,判断疾病预后。
        2.IBT法:免疫印迹法(IBT法15, 16)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。其试验原理为:将多种特异性过敏原提取物包被在特制的纤维膜条上,与待测样本进行反应。样品中含有的IgE类特异性抗体与过敏原结合,再与酶标记的单克隆抗人IgE抗体结合后,即可出现肉眼可见的颜色,以此和标准膜条比较,确定过敏原种类,IBT法以0.35 kU/L为临界判断值,检测值≥0.35 kU/L为阳性,<0.35 kU/L为阴性。孙院芳等10研究指出与皮肤点刺法相比,IBT法筛查过敏原阳性率为76.60%,而皮肤点刺法仅为53.19%,差异有统计学意义(P<0.05)。IBT法能一次性确定多种过敏原,目前已在国内广泛应用,属于半定量检测体系。
        3.RAST法:放射性变应原吸附试验法(radioallergosorbent test, RAST)其基本原理为:向纯化后吸附在固相载体上的过敏原中加入参考标准品和待测血清,并与放射性核素标记后的酶标二抗(抗IgE 抗体)进行反应,反应完成后测定固相的放射活性,最后根据作出的标准曲线求待测血清中过敏原特异IgE的水平17, 18。1967年Wide等报道的RAST试验已作为检测抗原特异性IgE抗体的体外试验方法,在当时对于点刺试验阴性而皮内试验阳性的假阳性患者,其鉴别优势已非常明显。RAST方法继续得到发展,RAST FEIA 使用的标记物为能产生荧光底物的酶,即荧光酶联免疫法,无放射性污染。目前临床上常用的ImmunoCAP系统就属于此方法12。该法具有操作简单、灵敏度高、特异性强和不受主观因素影响的优点19,Kyung Hee Park等的研究也指出ImmunoCAP系统由于其可靠性较高、重复性较好和与皮肤试验结果具有良好的相关性等优点。2014年EAACI提出ImmunoCAP系统是迄今为止常用的过敏原特异性IgE检测系统。但是,ImmunoCAP系统易受到交叉反应糖类决定簇(Cross-reactive Carbohydrate Determinant, CCD)的干扰,Sinson 等20的研究发现,17%的患者会出现因CCD干扰的假阳性情况。不能正确认识和分析假阳性结果,将会给患者生活带来不便,同时也会耗费大量的卫生资源。
        4.CMIA法:磁微粒化学发光酶免疫分析技术(chemiluminescence microparticle immunoassay, CMIA)通过间接法反应原理21, 22, 23, 24检测特异性过敏原 sIgE 抗体,将待检测样本、链霉亲和素标记的磁微粒、生物素标记的特异性过敏原捕获试剂混合,孵育,样本中sIgE 抗体与其过敏原特异性捕获试剂结合,加入辣根过氧化酶标记的二抗,形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物,经过洗涤后加入发光底物,发光强度与样本中的 sIgE 抗体含量成正比。根据已知浓度的校准品校准曲线,将待测物的发光强度代入校准曲线进行计算,即可得出样本中特异性过敏原 sIgE 抗体的含量。磁微粒化学发光酶免疫分析技术法敏感性和特异性较高、检测线性范围较宽(0.1~100 kU/L)、准确快速,是继酶免技术、放射免疫技术和荧光酶联免疫法技术之后发展起来的一种超高灵敏度的微量测定技术。美国Hycor公司的荧光磁微粒化学发光法25综合利用了化学发光技术的高灵敏度、磁性分离技术的快速且易自动化的特性及免疫分析的特异性,提升过敏原定量检测技术灵敏度和特异性,精密度好,线性范围宽,并结合分步式加样反应步骤可防止生物素及固相载体非特异性干扰。且对样本量要求低(每个测试4 μl),特别适于特异性过敏原检测。研究发现,Hycor公司的过敏原检测系统灵敏度高、特异性强, 常见的CCD和Biotin干扰因素影响很小。并且系统是按照最新的世卫组织参考标准进行校准的,提高了第三代过敏原sIgE定量检测的性能26
        5.ISAC技术:固相免疫过敏芯片技术(immuno solid-phase allergy chip, ISAC)27, 28, 29是一种可以同时对来自50多个过敏原种类的112种致敏成分进行特异性IgE检测的方法。该法可用于根据致敏呼吸、食物和交叉反应过敏原, 来确定受试患者的过敏表型,也是一种针对特定致敏成分的半定量测定IgE的方法。试验原理30:ISAC是一个微型免疫检测分析系统,利用生物芯片技术,在微阵列中固定过敏原组分,来自患者样本的IgE抗体与固定化的过敏原组分结合,通过荧光标记的抗IgE抗体检测出过敏反应的IgE抗体,并使用显微分析(microscopic analysis, MIA)计算机软件对每个特定致敏成分的荧光信号进行量化分析。结果 以标准化单位ISU-E(特定IgE的标准化单位)表示,检测线性范围0.3~15 ISU-E。研究指出ISAC试验的阳性结果最常用来观察动物来源的致敏成分;此外,实验结果显示,对树木、草、花粉以及尘螨过敏原也能检测到IgE。
        6.ddPCR技术:液滴数字PCR技术(droplet digital PCR, ddPCR)31,是将PCR混合试验在水油乳液中划分为数千或数百万个单独的液滴。PCR扩增终点后每个分区都被仔细检查并定义划分为阳性区域(有PCR产物的存在)或阴性区域(没有PCR产物存在),然后直接从阳性与总数的比率计算分区,使用二项式泊松统计计算结果。ddPCR具有灵敏度高,检测数据精确,线性范围较宽,尤其在过敏原拷贝量较低的目标DNA序列中,也能精准测量,对加入的抑制剂耐受性也较强。目前已将ddPCR应用于复杂食品和饲料基质中转基因存在的监测。有研究指出32, 第一次使用ddPCR方法对鱼类过敏原进行定量研究,发现ddPCR技术可以精确检测含量极低的鱼类过敏原。在ddPCR反应中也观察到额外反应产物的存在,这可能是种内变异、SNP或种间变异的结果,需要进一步的验证研究, 以便将ddPCR技术应用于特定鱼类和常规过敏原分析。Anderson和Maldarelli33的研究也指出ddPCR技术由于其准确度、灵敏度和特异度都极高的特性,而被应用于传染性疾病、过敏性疾病中的一些含量极低的致病病原体的检测。
        7.微阵列ELFA法:微阵列酶联免疫荧光法(enzyme-linked fluoroimmunoassay, ELFA)结合了超声波表面处理、微流体、微数组、酶联反应、图像处理5项技术, 以微流控芯片为载体, 可根据地区特性将多达40种过敏原固定在芯片反应区, 分析仪控制芯片上的血清样本, 清洗缓冲液, 酶联免疫吸附试验试剂和荧光显色试剂等在微流体通道的流动, 进行两步骤酶联免疫吸附试验;反应结束后通过高灵敏度的成像电荷耦合器截取荧光反应图像, 并处理芯片上的一组标准信号计算出校正曲线得到sIgE的半定量结果34, 35,检测线性范围为0~32 AU(1 AU=1 Class)。ELFA 法芯片内建质控标准曲线, 可排除环境影响因素。相较IBT法而言, 微流系统样本用量少,100 μl标本量即可检测,操作简便, 反应时间可缩短至半个小时左右, 满足临床准确快速的需求。
        8.纳米检测技术法:纳米技术(nanotechnologies)检测体外血清IgE的原理36为纳米粒子的磁性原理和ELISA技术相结合,纳米结构的材料通常被覆盖在生物传感器芯片表面上,提供固体底物,其表面涂上过敏原层。患者荧光标记的过敏原特异性IgE分子立即与涂层表面相互作用(即特异性过敏原),形成分子固定化复合物,荧光复合物通过读取器系统进行光学测量。有研究36指出纳米流体生物传感器结构不仅提供了1 ng/ml的最低检测灵敏度下限水平,而且加速了生物分子相互作用,从而将检测时间减少到几分钟。生物传感器纳米等离子体平台的自身优势明显:允许直接测量人体样品,而不需要任何预处理或预富集样品,总分析时间为15 min。同时,纳米技术37也克服了传统分子印迹材料吸附容量低、识别位点不均匀、传质速率慢等技术缺陷, 并将纳米材料的荧光、高灵敏等优良特征与分子印迹专一识别、广泛适用等特征相结合, 在食品安全、环境检测等领域必将得到广泛应用。
        9.LAMPT:循环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification technologies,LAMPT)LAMP方法38基于传统PCR原理基础上设计四个引物,包括一对外引物和一对内引物,用于特异性识别目标基因上的六个不同的DNA序列。同时采用BSTDNA聚合酶,在恒温条件下进行LAMP反应,循环扩增,产生不同大小的DNA链目标序列。由于BSTDNA聚合酶对DNA链位移的活性,在LAMP反应过程中不需要在高温下进行DNA变性,因此具有快速、灵敏和特异性高等特性用于检测过敏原组分,如蔬菜成分、病毒、真菌、细菌和寄生虫等。有研究39指出LAMP恒温扩增试验(对芹菜中过敏原组分鉴定)是一种高度特异和灵敏的检测方法,并指出糖蛋白Apig5是芹菜中引起过敏反应的主要过敏原组分。有研究40指出从霉变食品中分离并提取黄曲霉毒素进行纯培养,用LAMP方法进行高通量测序,从而快速鉴定过敏原组分。
        需要注意的是,sIgE含量可以客观反映机体的致敏情况,sIgE检测应该与皮肤试验互为补充,不能相互替代,二者均为变态反应疾病特异性诊断的重要手段12

三、过敏原检测的质量控制  为保证过敏原检测的质量,在试验开始时,要明确周围环境中的过敏原(空气、尘埃等)和样本中的内源性物质(血红蛋白、胆红素等)可接受的最高阈值,确保不会对实验结果造成干扰,并防止各过敏原之间的交叉污染,在进行体内实验时需要确保患者未接触其他可能的过敏原或者服用抗过敏药物等。此外,不论是定性,半定量检测还是定量检测,都需要明确检测产品的最低检出限、线性范围、参考值、精密度和准确度等,定量检测还需要进行线性评价。
        过敏原检测产品验证必须溯源到国家或国际标准品如WHO11/234标准,并分别对每一个过敏原进行检测。部分过敏原检测的标准品和质控品已商品化,对于未商品化的目标过敏原则需要人工提取、制备成梯度浓度的标准品,绘制(基质)标准曲线,并对这些标准品的特异性、最低检出限、线性范围、参考值、精密度和准确度等性能做出评价,制备质控品则需要在血清或血浆中添加各目标过敏原,检测各过敏原的含量并定值,尽量采用高值阴性样品作为阴性质控品39

四、结语与展望  综上所述,过敏原检测是过敏性疾病预防、诊断、治疗的重要技术手段,其检测方法多样,方法各有优劣。医生应根据患者自身情况,选择最佳试验方法,以提升检测效率。未来过敏原检测的发展趋势是过敏原组分解析(component resolved diagnosis, CRD)检测40,筛查过敏原中真正致敏的蛋白组分,确保临床过敏性疾病的精准治疗和有效预防。关于过敏原检测的仪器种类繁多,质控品良莠不齐,部分实验室采用的是企业参考品,各实验室室间质量控制缺乏可比性。期待国家相关部门能够提供更多种类的过敏原特异性IgE检测项目的标准物质,推动厂家使用标准化粗提取物,加强质量控制,使过敏原检测规范、精准41, 42

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