中华预防医学杂志    2014年 育龄妇女叶酸代谢通路关键酶基因多态性对血浆同型半胱氨酸水平的影响    PDF     文章点击量:3945    
中华预防医学杂志2014年
中华医学会主办。
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宋文芳 任灿晴 沈秋红 蒋跃明 刘楠
SongWenfang,RenCanqing,ShenQiuhong,JiangYueming,LiuNan
育龄妇女叶酸代谢通路关键酶基因多态性对血浆同型半胱氨酸水平的影响
An association study between gene polymorphism of the key enzyme′s folacin metabolism pathway and plasmatic homocysteine levels in fertile woman
中华预防医学杂志, 2014,(10)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.10.011
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投稿日期: 2014-07-11
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育龄妇女叶酸代谢通路关键酶基因多态性对血浆同型半胱氨酸水平的影响
宋文芳 任灿晴 沈秋红 蒋跃明 刘楠     
宋文芳 312000 绍兴巿计划生育宣传技术指导站
任灿晴 312000 绍兴巿计划生育宣传技术指导站
沈秋红 312000 绍兴巿计划生育宣传技术指导站
蒋跃明 复旦大学生命科学学院;江苏基谱生物科技发展有限公司
刘楠 军事医学科学院卫生学环境医学研究所
摘要: 目的  观察育龄妇女叶酸代谢通路关键酶基因多态性对血浆同型半胱氨酸水平的影响。方法  2012年通过整群抽样方法抽取535名江苏省绍兴市年龄为20~45岁之间的育龄妇女,平均年龄为28.2(95%CI:27.8~28.6)岁。抽取静脉血5 ml,加入抗凝剂EDTA或柠檬酸钠连续采集样本7 d,共采集1 465名调查对象血样,分离血细胞后,采用离心柱法进行DNA提取。然后对采集到的样本进行叶酸代谢关键酶基因多态性检测及血浆同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平分析,分析不同位点基因型的Hcy差异。结果  共检测了调查对象MTHFR、MS、MSR和CBS基因上的8个单核苷酸多态性(SNP)位点。MTHFR基因上的rs1801131位点基因型AA的Hcy平均浓度(8.99 μmol/L)高于CC (7.81 μmol/L)及CA(8.38 μmol/L)型,P<0.01。MTHFR基因上的rs1801133基因型为TT的调查对象Hcy平均浓度(11.10 μmol/L)高于CC(8.15 μmol/L)及CT(8.45 μmol/L)型,P<0.01。该两个位点的基因型组合AA–TT会导致Hcy浓度的升高(11.02 μmol/L),均高于其他基因型组合,特别是CC–CC基因型组合(7.83 μmol/L),风险系数是该基因型的1.41(95%CI:1.20~1.66)倍。结论  MTHFR基因上的rs1801131和rs1801133的基因突变可导致Hcy水平升高。
关键词 :叶酸;多态性;单核苷酸;高半胱氨酸
An association study between gene polymorphism of the key enzyme′s folacin metabolism pathway and plasmatic homocysteine levels in fertile woman
SongWenfang,RenCanqing,ShenQiuhong,JiangYueming,LiuNan     
Shaoxing Publicity and Technical Guidance for Family Planning, Shaoxing 312000, China
Corresponding author: Liu Nan, Email: LNQ555@126.com
Abstract:Objective  The effect of the gene polymorphism for the key enzyme′s folacin metabolism pathway on plasmatic homocysteine (Hcy) levels in fertile woman was observed.Methods  The subjects were from Shaoxing City, Jiangsu province in 2012, the selection criteria for the women of childbearing age were between 20-45 years old, with an average age of 28.2 (95%CI: 27.8-28.6) years old. Sample collection continued uninterrupted lasted seven days, a total of 535 samples were collected, venous blood with EDTA addition or sodium citrate to anticoagulant. After separation, the blood cells and blood plasma were cryopreserved. DNA was extracted using spin column method. All the samples were selected for the gene polymorphism testing of the key enzyme′s on folate metabolism and monitoring of plasmatic Hcy level.Results  Eight single nucleotide polymorphism (SNP) sites of methylenetetrahydrofolate reductase gene (MTHFR), methionine synthase gene (MS), synthetic methionine reductase gene (MSR) and cystathionine β synthase gene (CBS) were detected. It was found the genotype AA of the SNP sites-rs1801131 would result higher plasmatic Hcy levels (8.99 μmol/L) than the genotypes CC (7.81 μmol/L) and CA (8.38 μmol/L) (P<0.01). Similarly, the genotype TT of the SNP sites-rs1801133 was significantly responded to the increasing of Hcy levels (11.10 μmol/L) than the genotype CC (8.15 μmol/L) and CT (8.45 μmol/L), (P<0.01). The two sites of genotype combination of AA-TT could also result in the significant increase of Hcy levels (11.02 μmol/L) than other combined genotypes (genotypes CC-CC, CA-CC, CA-CT, AA-CC, AA-CT), especially the genotype CC-CC. And the risk factor was 1.41 (95CI: 1.20-1.66) times over the genotype CC-CC.Conclusion  The gene mutations of two SNP sites rs1801131 and rs1801133 in MTHFR would increase Hcy levels.
Key words :Folic acid;Polymorphism;Single nucleotide;Homocysteine
全文

叶酸代谢通路关键酶包括:5,10–亚甲基四氢叶酸还原酶(5, 10–methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)、甲硫氨酸合成酶(methionine synthetase,MS)、甲硫氨酸合成还原酶(methionine synthase reductase, MSR)、胱硫醚–β–合酶(cystathionine–beta–synthase,CBS),这些酶的基因变异能使叶酸代谢通路受阻,从而导致血浆同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)水平升高,造成各种危害。最常见的遗传变异是MTHFR基因,其rs1801133(C677T)突变位点使编码后丙氨酸被缬氨酸替代,导致酶活力降低至正常的50%左右,另外一个常见的rs1801131(A1298C)位转变也会造成MTHFR酶活性的降低,甲硫氨酸合成减少,Hcy转化成甲硫氨酸减少,细胞内Hcy增多,对胚胎的发育有毒性作用[1,2]。也有文章报道,其他3种基因(MS,MSR,CBS)的单核苷酸多态性(SNP)位点突变对血浆Hcy水平也有一定的影响。MS基因rs1805087(2756A>G)突变导致919位氨基酸由天冬氨酸转为甘氨酸,引起MS功能障碍,导致高半胱氨酸再甲基化途径受阻,体内高半胱氨酸水平和甲硫氨酸循环异常[3,4]。MSR A66G能抑制MS的活性,影响Hcy再甲基化,提高Hcy水平,研究表明,MSR基因的缺陷引起MS酶活性的下降是导致cblE型高胱氨酸尿症病的主要原因;携带有MSR野生型个体的甲硫氨酸合成增加[5,6,7,8,9]。到目前为止已发现CBS基因近30种突变,其基因的突变也可引起CBS的活性降低,从而导致Hcy的蓄积,进而引发一系列中毒症状。最常见的突变位点为T833C和G919A,均可引起CBS酶活性的部分丧失。
        研究者对叶酸代谢通路关键酶涉及的MTHFR、MSR、MS和CBS基因上8个位点(rs1131450、rs1801131、rs1801133、rs1801394、rs1805087、rs28372871、rs2850144、rs326119)进行了SNP多态性检验,检测各个SNP位点对血浆Hcy水平的影响,可对育龄妇女的产前诊断提供依据,并采取一定的措施进行干预,将有助于减少出生缺陷的发生率。

对象与方法  

1.对象:  本调查对象均来自江苏省绍兴市,2012年通过整群抽样方法抽取1 465名年龄在20~45岁之间的育龄妇女,平均年龄为28.2(95%CI:27.8~28.6)岁。样本采集持续不间断历时7 d,共完成样本采集1 452份。最终资料完整者有535名。本研究通过了绍兴市人口与计划生育伦理审查委员会的审查。在获得知情同意后,进行叶酸代谢关键酶基因变异检测及血浆Hcy水平监测。血液样本均在采集当天进行Hcy的检测,保证检测结果之间的差异最小。抽取静脉血5 ml,加入抗凝剂EDTA或柠檬酸钠,分离血细胞后,血浆与血细胞分别冷冻保藏。采用离心柱法提取DNA。

2.方法:  (1) SNP位点多态性检测:分别对MTHFR、MS、MSR、CBS基因上的SNP位点进行基因检测,检测方法采用Real–time PCR扩增后测序和生物信息学分析SNP位点分析。(2) Hcy水平的测定:采集调查对象空腹时静脉血5 ml,用EDTA抗凝,离心分离出血浆后置于–80 ℃保存。测定时先将血浆中的蛋白结合的Hcy全部还原成Hcy单体,在通过酶反应转化成S–腺苷同型半胱氨酸(S–adenosine homocysteine, SAH),最后通过总半胱氨酸的测定试剂盒(挪威Axis–Shield公司)检测SAH的量来计算总的Hcy的量。所用仪器为TBA–40FR全自动生化分析仪(日本东芝公司),利用终点法,加入13 μl样品,主波长设为340 nm,副波长设为700 nm,反应方向为下降反应,37 ℃反应10 min,根据校准曲线计算Hcy的含量。实验中每个样本检测2次,取平均值作为结果。

3.统计学分析:  数据采用Excel 2003软件进行数据的初步录入,应用SPSS 17.0软件进行分析,应用拟合优度χ2检验(Goodness–of–fit Chi–square test)分析各SNP位点基因型频率的分布是否符合哈迪–温伯格平衡定律(Hardy–Weinberg equilibrium, HWE)。SNP各位点基因型在Hcy水平上的差异采用方差分析。基因型间有差异时进行Post Hoc Tests检验,检验方法选择LSD法。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结果  

1.Hcy的测定和SNP位点多态性检验:  对收集到的1 465名调查对象的血液样本进行Hcy水平的测定,其中成功测定1 452份(99.1%),测定的半胱氨酸平均水平8.75 (95%CI:8.57~8.92) μmol/L。资料完整的535名调查对象中,20~25岁的样本209名,Hcy平均值9.58 μmol/L;26~30岁的对象195名,Hcy平均值8.42 μmol/L;31~35岁的对象84名,Hcy平均值为8.09 μmol/L;36~40岁的对象47名,Hcy平均值为7.77 μmol/L。MTR基因上共检测到3个SNP位点,分别为rs1131450(956名,65.3%)、rs1805087(1 393名,95.1%)、rs28372871(1 384名,94.5%);MTHFR基因上共检测到2个SNP位点,分别为rs1801131(1 393名,95.1%)、rs1801133(1 401名,95.6%);MTRR基因上共检测到2个SNP位点,分别为rs1801394(1 401名,95.6%)、rs326119(1 396名,95.3%);CBS基因检测到1个SNP位点,为rs2850144(1 353名,92.4%),结果如表1所示。共有6个SNP多态性位点基因型满足HWE检验,位点rs1801133(P=0.012)和位点rs326119(P=0.041)不能满足HWE检验,结果如表2所示。

表1叶酸代谢通路关键酶相关基因SNP位点信息
表2SNP多态性位点基因型的HWE检验结果

2.SNP基因多态性对血浆Hcy水平的影响:  经HWE检验之后,对其中满足HWE平衡的6个SNP多态性位点的基因型进行分类,同时将rs1801133位点纳入本次分析。分析显示,rs1801131和rs1801133SNP位点各基因型间Hcy水平具有统计学差异(P<0.01),结果如表3所示。组间分析表明,rs1801131的基因型AA和rs1801133的基因型TT测定的Hcy水平均高于其他两种基因型。

表3SNP基因多态性对血浆Hcy水平的影响

3.SNP位点rs1801131和rs1801133联合作用对血浆Hcy水平的影响:  SNP位点rs1801131和rs1801133突变基因对血浆Hcy水平的影响具有统计学意义,故将该两个SNP位点的联合作用进行分析,SNP位点rs1801131基因突变产生的3种基因型为CC、CA、AA;SNP位点rs1801133(C677T)基因突变产生的3种基因型为CC、CT、TT。调查人群中SNP位点rs1801131和rs1801133共出现8种基因型组合,分别为:CC–CC(47名)、CC–CT(1名)、CA–CC(234名)、CA–CT(182名)、CA–TT(2名)、AA–CC(259名)、AA–CT(435名)、AA–TT(229名)。各组合基因型间的Hcy水平具有统计学差异(F=26.64,P<0.01),见表4。组间分析显示,基因型AA–TT测得的Hcy水平高于其他类型的基因型组合,特别是基因型CC–CC,风险系数是该基因型的1.41 (95%CI:1.20~1.66)倍。

表4rs1801131和rs1801133联合作用对血浆Hcy浓度的影响

讨论  叶酸是Hcy代谢途径中重要的甲基供体,叶酸缺乏则会导致高Hcy血症。Hcy具有细胞毒性,可使巯基氧化产生自由基,引起DNA损伤和细胞凋亡。另外Hcy过多还可产生大量SAH,后者是体内所有甲基转移反应的竞争抑制剂,干扰蛋白质、脂类和DNA等的甲基化反应,产生错误蛋白和无功能蛋白。血浆中Hcy浓度的升高与心脑血管疾病、糖尿病、肾病和风湿性疾病的临床诊断具有一定的相关性[9,10]
        另有研究表明,Hcy浓度随着年龄的升高而升高[10],在本研究中并未出现该种情况。虽然不同年龄段的Hcy浓度有统计学差异(P<0.05),但是20~25岁年龄段的Hcy浓度高于其他年龄段。41~45岁年龄段的样本Hcy的平均浓度虽然高于其他年龄段,但不具有统计学意义。对20~25岁年龄段Hcy浓度进行分析发现,血浆Hcy浓度增高的样本其SNP位点rs1801131和rs1801133基因型组合多为AA–TT。说明SNP多态性位点的高危基因型是Hcy浓度升高的主要原因。因此通过对育龄妇女开展叶酸代谢通路关键酶基因变异检测及血浆Hcy浓度监测,发现基因多位点变异和高Hcy血症者,并采取一定的措施进行叶酸干预,将有助于减少出生缺陷的发生率。
        利用绍兴地区人口和计划生育管理与服务网络及已建立的生殖健康信息系统的优势,针对准备怀孕妇女开展叶酸代谢通路关键酶基因变异检测及Hcy浓度监测,建立和发展以孕前–围孕个性化补充叶酸为重点的出生缺陷人群干预的基本框架,提出个性化孕前咨询模式和流程;开展出生缺陷人群干预效果评估,发展以一级预防为主的出生缺陷人群综合预防模式和方案,为政府部门组织实施出生缺陷一级预防、实施出生缺陷低成本高效率预防策略提供技术和信息支撑。

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