中华预防医学杂志    2014年08期 肠道病毒71型灭活疫苗热稳定性研究    PDF     文章点击量:4464    
中华预防医学杂志2014年08期
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张莹 李琦涵 廖芸 刘龙丁 李海巍 董承红
ZhangYing,LiQihan,LiaoYun,LiuLongding,LiHaiwei,DongChenghong
肠道病毒71型灭活疫苗热稳定性研究
Heat effect stability of inactivated enterovirus 71 vaccine
中华预防医学杂志, 2014,48(8)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.08.015
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投稿日期: 2013-11-27
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肠道病毒71型灭活疫苗热稳定性研究
张莹 李琦涵 廖芸 刘龙丁 李海巍 董承红     
张莹 650118 昆明,中国医学科学院医学生物学研究所 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室
李琦涵 650118 昆明,中国医学科学院医学生物学研究所 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室
廖芸 650118 昆明,中国医学科学院医学生物学研究所 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室
刘龙丁 650118 昆明,中国医学科学院医学生物学研究所 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室
李海巍 650118 昆明,中国医学科学院医学生物学研究所 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室
董承红 650118 昆明,中国医学科学院医学生物学研究所 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室
摘要: 目的  研究肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞)生产过程中的中间产品及成品的热稳定性。方法  将不同批次EV71灭活疫苗的病毒收获液、疫苗原液以及疫苗成品分别置于不同温度保存。第0、6、12、24个月时选取存放于–20 ℃、4 ℃的病毒收获液及–20 ℃的疫苗原液的样品,第0、1、3、6、12个月时选取存放于4 ℃的疫苗原液的样品,第0、6、12、24个月时选取存放于4 ℃的疫苗成品的样品,第0、7、14、28、42、60天时选取存放于25 ℃的疫苗成品的样品,第0、3、7、14、21天时选取存放于37 ℃的疫苗成品的样品,检测样品的病毒感染性滴度(lgCCID50/ml;CCID50,cell culture infective dose 50%,细胞培养半数感染量)、抗原含量、内毒素含量、pH值等;对1 800只BLAB/c小鼠进行疫苗成品的腹腔免疫注射,同时针对每个温度下不同保存时间设立对照组,每组10只小鼠(注射无病毒抗原的稀释液),共150只。接种4周时每只小鼠采集尾静脉血500 μl,检测血清的中和抗体效价,计算疫苗成品的半数有效量(ED50)。采用随机区组方差分析,对不同温度下,不同保存时间的各项指标进行比较。结果  EV71灭活疫苗的病毒收获液在–20 ℃条件下,保存0、6、12、24个月时病毒滴度分别为(6.67±0.13)、(6.56±0.09)、(6.52±0.04)、(6.39±0.16)lgCCID50/ml;4 ℃条件下,各时间点的病毒滴度分别为(6.67±0.13)、(6.41±0.13)、(6.19±0.18)、(5.97±0.09)lgCCID50/ml,均随保存时间的延长呈下降趋势(F值分别为9.81和44.16,P值均<0.05)。疫苗原液在4 ℃条件下,保存0、1、3个月时的抗原含量均为(3 626.67±1 382.56)EU/ml,保存6和12个月时分别为(2 080.00±876.36)、(951.17±346.35)EU/ml。疫苗成品在4 ℃条件下,保存0、6、12、24个月时的效力分别为(31.00±2.71)、(32.93±3.22)、(39.37±3.44)、(46.04±3.25) EU/ml;在25 ℃条件下,保存0、7、14、28、42、60 d的ED50分别为(31.00±2.71)、(32.23±2.66)、(34.70±1.77)、(40.04±2.10)、(47.78±1.93)、(56.97±0.50) EU/ml;在37 ℃条件下,保存0、3、7、14、21 d的效力分别为(31.00±0.00)、(36.20±0.00)、(41.87±0.50)、(53.25±0.50)、(64.84±0.58) EU/ml,ED50均随时间延长呈上升趋势,与初始值差异均有统计学意义(F值分别为28.49、215.15和156.12,P值均<0.05)。结论  在–20 ℃保存24个月或4 ℃保存6个月以内的EV71灭活疫苗病毒收获液,在–20 ℃保存24个月或4 ℃保存3个月以内的疫苗原液以及在4 ℃条件下保存24个月或25 ℃保存28 d或37 ℃保存7 d以内的疫苗成品,其各项质量指标均具有较好的稳定性。
关键词 :肠道病毒A型,人;疫苗,灭活;温度;人二倍体细胞;热稳定性
Heat effect stability of inactivated enterovirus 71 vaccine
ZhangYing,LiQihan,LiaoYun,LiuLongding,LiHaiwei,DongChenghong     
Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases, Institute of Medical Biology, Kunming 650118, China
Corresponding author: Dong Chenghong, Email: chenghongdong@imbcams.com.cn
Abstract:Objective  To investigate the effect of temperature on the stability of intermediate and final products of inactivated enterovirus 71 vaccine, which was prepared in human diploid cells.Methods  The different batches of harvest viral cultures, the vaccine stock solutions and the final productions of inactivated enterovirus 71 vaccine were stored at different temperatures. The samples of viral culture stored at -20 ℃ or 4 ℃ were harvested at 0, 6, 12 and 24 months later. The samples of vaccine stock solutions stored at -20 ℃ were harvested at 0, 6, 12 and 24 months later, and that stored at 4 ℃ were harvested at 0, 1, 3, 6 and 12 months later. The samples of finial products were harvested at different time points (0, 6, 12 and 24 months for storing at 4 ℃; 0, 7, 14, 28, 42 and 60 d for storing at 25 ℃; 0, 3, 7, 14 and 21 d for storing at 37 ℃). The viral titer, antigen content, antigen purity, endotoxin content, effectiveness, pH and appearance of samples were determined, respectively. A total of 1 800 BLAB/c mice were immunized by vaccine and 150 control mice were injected by diluents without antigen via intraperitoneal. The tail vein blood (500 μl per mouse) from 1 950 mice were harvested after 4 weeks post injected. The neutralization antibody titers of the serum were tested to calculate the half effective dose (ED50) of final products. All results were analyzed using analysis of variance to compare the differences of the above indexes.Results  The viral titers of harvest viral culture of inactivated EV71 vaccine were (6.67±0.13), (6.56±0.09), (6.52±0.04), (6.39±0.16) lgCCID50/ml (CCID50, the half cell culture infective dose) after 0, 6, 12 and 24 months storage at -20 ℃; and (6.67±0.13), (6.41±0.13), (6.19±0.18), (5.97±0.09) lgCCID50/ml at 4 ℃. The viral titers reduced with time (F=9.81 or 44.16, P<0.05). The antigen contents of the vaccine stock solution were maintained at (3 626.67±1 382.56) EU/ml within 3 months at 4 ℃, but were (2 080.00±876.36), (951.17±346.35) EU/ml at 6 and 12 months, respectively. The ED50 of the final production were (31.00±2.71), (32.93±3.22), (39.37±3.44) and (46.04±3.25) EU/ml after 0, 6, 12 and 24 months storage at 4 ℃, but were (31.00±2.71), (32.23±2.66), (34.70±1.77), (40.04±2.10), (47.78±1.93) and (56.97±0.50) EU/ml at 0, 7, 14, 28, 42 and 60 days at 25 ℃, and were (31.00±0.00), (36.20±0.00), (41.87±0.50), (53.25±0.50) and (64.84±0.58) EU/ml at 0, 3, 7, 14 and 21 days at 37 ℃, respectively. The ED50 had increased with the time by and had significantly differences compared with the beginning level (F=28.49, 215.15 or 156.12, P<0.05).Conclusion  There is a good stability of the intermediate and final productions of inactivated enterovirus 71 (EV71) vaccines, within 24 months at -20 ℃ or 6 months at 4 ℃ storage for viral culture, 24 months at -20 ℃ or 3 months at 4 ℃ storage for stock solution and 24 months at 4 ℃ or 28 d at 25 ℃ or 7 d at 37 ℃ storage for finial vaccine.
Key words :Enterovirus A, human;Vaccines, inactivated;Temperature;Human diploid cell;Stability
全文

良好的疫苗质量及适宜的保存条件是保证疫苗能够有效发挥预防保护作用的重要条件。疫苗的热稳定性直接关系到疫苗对储存、运输条件的要求,也关系到疫苗有效期的长短,并最终影响疫苗产品的免疫原性及所产生的免疫效果。
        中国每年感染流行性手足口病的患儿超过150万例[1,2,3],但是迄今为止尚无一种能够有效预防和控制该病的疫苗问世。在此背景下,针对可导致80%以上重症及死亡手足口病病例的主要病原––肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)[4,5],笔者利用已适应于人胚肺二倍体细胞(KMB–17)细胞基质的EV71 FY23–KB株,开展EV71病毒灭活疫苗的研发[6,7,8]。由于该疫苗是首创新疫苗,所以包括热稳定性在内的很多指标都没有具体的参考标准。笔者通过分析EV71灭活疫苗(人二倍体细胞)生产过程中,不同阶段的产品在不同温度条件下,其稳定性随时间的变化情况,从而评价疫苗对温度的敏感程度,现将结果报告如下。

材料与方法  

一、材料  

1.实验动物:  健康8周龄无特定病原体(SPF)级雌性近交系BLAB/c小鼠1 950只,每只体重为20~25 g,由中国医学科学院实验动物研究所提供。

2.实验细胞:  用于疫苗生产的人胚肺二倍体细胞(KMB–17),为中国医学科学院医学生物学研究所提供,其培养于含体积分数为8%的小牛血清MEM细胞培养液中。

3.主要试剂:  不同批次的EV71病毒收获液、EV71灭活疫苗原液和疫苗成品由中国医学科学院医学生物学研究所在通过良好操作程序(good manufacturing practices,GMP)认证的车间内进行制备。其中,病毒收获液批次分别为200801、200802、200901、200902、201001、201002、201101和201102,疫苗原液批次分别为200801–1、200802–1、200901–1、200902–1、201001–2和201002–1,疫苗成品批次分别为20100701、20100702、20110104和20110105。EV71抗原检测试剂盒由中国医学科学院医学生物学研究所研制[9],参比品由中国食品药品检定研究院赠送,内毒素检测用鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司,细菌内毒素工作标准品和内毒素检查用水由厦门鲎试剂厂生产。

4.主要仪器:  Synergy 4型多功能酶标仪购自美国BioTek公司,e2695型高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪购自美国Waters公司,HI9318型pH仪器购自法国Hanna公司。

二、方法  

1.病毒收获液的病毒滴度及抗原含量检测:  将经检验合格的、不同批次的100 ml病毒收获液2等分后,分别置于4 ℃和–20 ℃冰箱中保存,分别于第0、6、12、24个月时,取出5 ml病毒收获液样品进行感染性滴度(lgCCID50/ml;CCID50,cell culture infective dose 50%,细胞培养半数感染量)检测,具体方法见文献[10],同时进行抗原含量(EU/ml)的检测,具体方法见文献[11]

2.疫苗原液的抗原含量、抗原纯度及内毒素检测:  将不同批次的150 ml疫苗原液2等分后,分别置于4 ℃和–20 ℃冰箱中保存。分别于第0、6、12、24个月时,选取保存于–20 ℃的10 ml疫苗原液,分别于第0、1、3、6、12个月时,选取保存于4 ℃的10 ml疫苗原液,对其分别进行抗原含量、抗原纯度及内毒素含量的检测。(1)抗原含量检测:参照文献[11]中介绍方法,进行疫苗原液抗原含量的检测。(2)抗原纯度检测:采用HPLC仪检测各个时间点样品EV71的抗原纯度,并与参比品图谱进行抗原特征图谱一致性的比较分析。(3)内毒素含量检测:参照文献[12]中介绍方法,使用鲎试剂分别检测保存于4 ℃和–20 ℃下的各个时间点样品中的内毒素含量。

3.疫苗成品的抗原含量、内毒素、效力及物理性检测:  将不同批次的180 ml疫苗成品3等分后,分别保存于4 ℃、25 ℃、37 ℃温度下。于第0、6、12、24个月时,采集保存于4 ℃的疫苗成品的样品10 ml;于第0、7、14、28、42、60天时,采集保存于25 ℃的疫苗成品的样品10 ml;于第0、3、7、14、21天时,采集保存于37 ℃的疫苗成品的样品10 ml。对这些样品分别进行抗原含量、内毒素、效力及物理性质检测。(1)抗原含量检测:参照文献[11]中介绍方法,进行疫苗成品抗原含量的检测。(2)内毒素含量检测:参照文献[12]中介绍方法,进行疫苗成品内毒素含量的检测。(3)体内效力检测:对选取的样品进行4倍系列稀释,共3个稀释度(原倍、1/4倍和1/8倍),每个稀释度样品均选取10只BLAB/c小鼠进行腹腔免疫注射,共1 800只,同时针对每个保存温度设立对照组,每组10只小鼠(注射无病毒抗原的稀释液),共150只。免疫接种4周时,每只小鼠采集尾静脉血500 μl,并进行血清分离。按照《中华人民共和国药典(2010版)》规定,采用中和实验(微量细胞病变法)检测待检血清的中和抗体效价[6],计算半数有效量(ED50),即疫苗在体内引起半数动物特异性抗体阳性反应的剂量[13,14],评价疫苗的效力。(4)物理性质检测:不同批次疫苗成品的pH值检测使用pH仪器完成。外观(包括成品是否仍为乳白色悬液)及异物检查(包括成品中的沉淀物、杂质、颗粒物等的检查)是在有GMP资质的生产车间中,由经验丰富的生产人员完成。

4.统计学分析:  使用SPSS 18.0软件进行统计学分析。不同温度条件下,不同保存时间采集的病毒收获液、疫苗原液或者疫苗成品样品,对其病毒滴度、抗原含量、内毒素含量、抗原纯度、ED50等指标均服从正态分布,用±s表示。采用随机区组方差分析,以不同批次为区组,分别对不同温度条件下,不同保存时间的各项指标进行差异性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.病毒收获液在不同温度下的稳定性:  病毒收获液在–20 ℃条件下,不同保存时间的病毒感染性滴度差异有统计学意义(F=9.81,P<0.05),且随保存时间的延长呈下降趋势,最多下降0.28 lgCCID50/ml,而抗原含量差异无统计学意义(F=1.00,P>0.05);在4 ℃条件保存6个月以内,病毒感染性滴度下降不超过0.27 lgCCID50/ml(P<0.05),抗原含量虽有略微下降(P<0.05)但均大于1 280 EU/ml,而6个月后,病毒收获液的病毒滴度和抗原含量的变化均较大(P值均<0.05)。见表1

表1不同温度下不同保存时间的病毒收获液质量检测指标变化(±s)

2.疫苗原液在不同温度下的稳定性:  病毒原液在–20 ℃条件下,不同保存时间的抗原含量、抗原纯度、内毒素差异均无统计学意义(F值分别为2.47、1.00、1.00,P值均>0.05);在4 ℃条件下,保存3个月以内,各时间点抗原含量的差异均无统计学意义(P值均>0.05),但保存6个月时开始下降(P<0.05),而各保存时间点抗原纯度差异有统计学意义(F=3.16,P<0.05),且均大于95%。见表2

表2不同温度下不同保存时间的疫苗原液质量检测指标的变化情况(±s)

3.疫苗成品在不同温度下的稳定性:  疫苗成品在–20 ℃条件下,不同保存时间的外观均为乳白色悬液且无异物,而仅ED50的差异有统计学意义(F=28.49,P<0.05);疫苗成品在25 ℃和37 ℃条件下,不同保存时间的外观均为乳白色悬液且无异物,而均仅抗原含量和ED50的差异有统计学意义(抗原含量的F值分别为29.31和19.09,效力的F值分别为215.15和156.12,P值均<0.05)。见表3

表3不同温度下不同保存时间的疫苗成品质量检测指标的变化情况(±s)

讨论  疫苗作为一种重要的生物制品,具有对温度敏感的特性,因此在疫苗生产、保存及运输中疫苗的热稳定性情况是疫苗研发过程中一项必不可少的内容[15,16]。EV71灭活疫苗作为尚无具体参考标准的新疫苗,生产过程中的病毒收获液、疫苗原液、疫苗成品的热稳定性实验的分析及评价对该疫苗的应用具有重要意义。
        通过本研究发现,EV71灭活疫苗病毒收获液在–20 ℃条件下保存24个月或4 ℃保存6个月以内,感染性滴度虽略有降低,但抗原含量指标的差异无统计学意义。超过这一保存时间,样品的感染性滴度和抗原含量出现差异。提示,保存温度和时间是病毒收获液质量指标的重要影响因素。
        笔者发现,由病毒原液进一步加工而成的EV71灭活疫苗原液在–20 ℃条件下保存24个月或4 ℃保存6个月以内,抗原含量及纯度基本维持稳定。超过该保存期限,抗原含量表现出显著下降的趋势。同时,在不同保存温度下,整个保存过程中内毒素的含量均未超过国家药典规定的合格范围(≤200 EU/ml)[17]
        本实验检测EV71灭活疫苗成品的热稳定性,结果表明,成品液于4 ℃保存24个月,25 ℃保存28 d,37 ℃保存7 d以内,其外观、内毒素、pH值和抗原含量均无明显变化,ED50均在企业制定合格标准60 EU/ml范围内。但超过这一期限,抗原含量和ED50均有变化(P<0.05),尤其是成品在37 ℃保存21 d时,效力指标ED50已经超过合格范围(>60 EU/ml)。
        综上所述,EV71灭活疫苗的病毒原液、疫苗原液以及疫苗成品在低温条件下(4 ℃或更低温度)均能够维持各项质量指标在合格范围内,保持良好的稳定性。然而,在短期内、相对高温条件下(4 ℃以上),EV71灭活疫苗(人二倍体细胞)的中间品以及疫苗成品的各项质量指标也能够保持相对稳定。
        由此可见,正常的疫苗冷链(2~8 ℃)保存及运输条件已经能够满足EV71灭活疫苗(人二倍体细胞)成品的稳定性要求;而在冷链被破坏的情况下(25 ℃以上),疫苗成品在短期内其效力也可保持稳定。

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