中华预防医学杂志    2014年08期 应用Taqman实时PCR法检测禽肉中沙门菌的研究    PDF     文章点击量:3490    
中华预防医学杂志2014年08期
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闫琳 王晓英 郭云昌 裴晓燕 余东敏 杨大进
YanLin,WangXiaoying,GuoYunchang,PeiXiaoyan,YuDongmin,YangDajin
应用Taqman实时PCR法检测禽肉中沙门菌的研究
Study on detection of Salmonella in poultry samples by real-time PCR with Taqman probes
中华预防医学杂志, 2014,48(8)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.08.016
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投稿日期: 2014-05-12
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应用Taqman实时PCR法检测禽肉中沙门菌的研究
闫琳 王晓英 郭云昌 裴晓燕 余东敏 杨大进     
闫琳 100022 北京,国家食品安全风险评估中心风险监测与预警部
王晓英 中国动物疫病预防控制中心兽医公共卫生处人畜共患病防控室
郭云昌 100022 北京,国家食品安全风险评估中心食源性疾病监测部
裴晓燕 100022 北京,国家食品安全风险评估中心风险监测与预警部
余东敏 100022 北京,国家食品安全风险评估中心微生物实验部
杨大进 100022 北京,国家食品安全风险评估中心风险监测与预警部
摘要: 目的  建立敏感快速的检测禽肉中沙门菌的实时PCR法。方法  以invA基因为基础,建立RT–PCR法并验证其特异性。选用肠炎沙门菌CMCC 50041,制备不同浓度的纯菌液,用RT–PCR进行检测,制作标准曲线并计算扩增效率。进行人工染菌实验,染菌量分别为每25 g鸡肉样本1、10、102、103、104、105和106 CFU。分别在增菌0、4、8、12、18 h取1 ml培养液,提取DNA进行RT–PCR检测,并同时用PCR和传统方法进行检测,比较3种方法检测的敏感性和特异性。采集16份市售整鸡样本,用这3种方法进行检测,进一步比较三者的阳性检出情况。结果  建立的RT–PCR法特异性好,对纯菌液的最低检测限为5.2×103 CFU/ml,在5.2×103~5.2×1010 CFU/ml范围内,菌浓度的对数值和检测结果的Ct值线性关系良好,R2=0.999。人工染菌样本在增菌12 h后,RT–PCR法检出限可达1 CFU/25 g,与PCR检测的敏感性一致,比传统方法的检出限敏感10倍。根据增菌12 h的检测结果,建立了RT–PCR样本标准曲线。采用RT–PCR检测16份禽肉样本,检出7份阳性,与PCR一致,高于传统方法(5份阳性)。根据样本标准曲线,对检测样本进行定量分析,确定了阳性样本中初始含量菌。结论  所建立的RT–PCR具有快速简便、敏感特异等优点,适用于禽肉中沙门菌的快速定量检测。
关键词 :聚合酶链反应;沙门菌,肠炎;食品检查
Study on detection of Salmonella in poultry samples by real-time PCR with Taqman probes
YanLin,WangXiaoying,GuoYunchang,PeiXiaoyan,YuDongmin,YangDajin     
Division of Risk Surveillance and Alert, China National Center for Food Safety Risk Assessment, Beijing 100022, China
Corresponding author: Wang Xiaoying, Email: xywang6401@126.com
Abstract:Objective  To develop a RT-PCR method for a rapid and sensitive detection of Salmonella in poultry samples.Methods  The RT-PCR method was established and its specificity was testified on the basis of invA gene. Serial 10-fold diluted pure suspension culture of CMCC 50041 was detected by RT-PCR, the standard curve was constructed and the amplification efficiency was calculated. Artificially contaminated experiment was done, six artificially-inoculated samples containing final concentration of Salmonella CMCC 50041 (1, 10, 102, 103, 104, 105 and 106 CFU per 25 g poultry samples) were prepared respectively. All the samples were incubated for 0, 4, 8, 12 and 18 h and the DNA was extracted for RT-PCR detection, meanwhile by PCR detection and the traditional method. The sensitiveness and specificity were compared among the three methods. At the same time, 16 samples of retail whole poultry were collected from markets and detected by the above three methods as well, and thereby to further compare the positive detection among the three methods.Results  The established RT-PCR method was specific for the detection of Salmonella. The sensitivity was 5.2×103 CFU/ml for pure Salmonella culture without enrichment. Correlation coefficients of standard curves constructed using the Ct versus log value of concentration of Salmonella showed good linearity over a 8-log dynamic range (5.2×103-5.2×1010 CFU/ml), with the R2 at 0.999. RT-PCR detection limit for artificially contaminated samples after enriching for 12 h was 1 CFU/25 g sample, which was the same with the limit of PCR and 10 times more sensitive than the limit of traditional method. Standard curve of sample after enrichment for 12 h was established. Seven of 16 samples were detected positive by RT-PCR, which were also tested positive by PCR, while only five samples were positive by traditional method. The positive ones were quantitatively analyzed using standard curve of sample and determined the initial Salmonella numbers of CFU/25 g.Conclusion  The established RT-PCR technology was simple, rapid, sensitive and specific, which was suitable to quickly detect Salmonella in poultry samples.
Key words :Polymerase chain reaction;Salmonella enteritidis;Food inspection
全文

沙门菌是对人类和动物健康具有极大危害的一类致病菌,由它引起的食物中毒在世界各国的细菌性食物中毒中常位居前列。RT–PCR是近年来较新的检测技术,其基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实现对整个PCR进程的实时监测,并能对起始模板进行定量分析,具有敏感、特异、快速、高效的优点[1,2,3]。该技术应用于食品中致病菌检测方面的研究在国外开展较早,国内相关报道较少。笔者以沙门菌特异的invA基因为目的片段,建立检测沙门菌的RT–PCR法,通过菌液敏感性实验和人工染菌实验,确定该方法的敏感性,并与PCR及传统方法检测结果进行比较,最后应用该方法检测16份市售样本,评价其应用价值。

材料与方法  

1.菌株:  肠炎沙门菌CMCC 50041等15株沙门菌标准株、15株沙门菌分离株及18株非沙门菌(包括阪崎肠杆菌、阴沟肠杆菌、普通变性杆菌、大肠埃希菌ATCC 25922、肠出血性大肠埃希菌O157∶H7、产酸克雷伯菌、奇异变形杆菌、成团泛菌、蜂房哈夫尼菌、杨氏枸橼酸杆菌、单增李斯特菌CMCC 54004、金黄色葡萄球菌ATCC 26071)由笔者所在实验室保存。

2.培养基和试剂:  营养肉汤、营养琼脂、CHROMagar沙门菌显色培养基(CAS)及亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)购自北京陆桥技术有限公司;TaqDNA聚合酶、细菌基因组DNA快速提取试剂盒购自原平皓(天津)生物技术有限公司;Premix Ex Taq?购自宝生物工程(大连)有限公司;API 20E试剂条为法国梅里埃产品,购自北京威泰科公司。

3.引物和探针:  引物和Taqman探针序列分别为:PsalF:5′–GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA–3′,PsalR:5′–TCATCGCACCGTCAAAGGAACC–3′,PsalC:5′–FAM–TTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTG–TTGTAMRA–3′[4]。由宝生物工程(大连)有限公司合成,扩增片段总长度284 bp。

4.PCR:  25 μl扩增体系:H2O 17.9 μl,10×PCR缓冲液2.5 μl,25 μmol/L MgCl2 2 μl,10 μmol/L dNTP 0.5 μl,10 μmol/L PsalF 0.5 μl,10 μmol/L PsalR 0.5 μl,5 U/μl Taq酶0.1 μl,DNA模板1 μl。扩增反应程序:94 ℃预变性10 min;94 ℃变性30 s、65 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共30个循环;72 ℃终延伸7 min;于4 ℃下保存。用1×Tris–硼酸配制1.5%的琼脂糖凝胶,取PCR扩增产物上样,每孔5 μl。在75 V电压下电泳1 h,用Gel–Doc凝胶成像分析系统UVI观察结果并拍照。

5.RT–PCR:  25 μl扩增体系:Premix Ex Taq? 12.5 μl,10 μmol/L PsalF 0.5 μl,10 μmol/L PsalR 0.5 μl,10 μmol/L PsalC 0.5 μl,H2O 10 μl,DNA模板1 μl。扩增程序:95 ℃预变性2 min;95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s,在FAM通道采集荧光信号,40个循环。同一模板,平行做2管RT–PCR检测。Ct值在15~40则认为扩增结果为阳性;Ct值小于15,需要将模板稀释后重做;40个循环内都没有Ct值,则认为样本为阴性。以沙门菌和非沙门菌的DNA为模板,用所建立的RT–PCR方法进行特异性验证。

6.菌液敏感性实验:  取纯培养的CMCC 50041,用生理盐水制菌悬液(约1010 CFU/ml),采用系列稀释法稀释至10–10,各浓度菌液取1 ml,用试剂盒提取DNA,进行RT–PCR检测。同时选取10–7、10–8、10–9稀释度的菌悬液涂布营养琼脂板,37 ℃培养18~24 h,菌落计数。

7.人工染菌实验:  取纯培养的CMCC 50041,用生理盐水制菌悬液(约109 CFU/ml),采用系列稀释法进行稀释,选取10–6、10–7、10–8稀释度的菌悬液涂布营养琼脂板,37 ℃培养18~24 h,菌落计数,制备好的各稀释度的菌液于4 ℃冰箱保存备用。
        根据菌落计数结果,确定菌悬液的浓度。无菌操作分别称取同一只鸡的25 g鸡肉样本于225 ml的SC选择性增菌液中,共8份。分别取1 ml不同浓度的菌液,接种鸡肉样本。接种菌的终浓度大致分别为每25 g样本1、10、102、103、104、105、106 CFU,1份样本不染菌为背景值对照,用均质器拍击混匀,于37 ℃静置培养。分别在增菌0、4、8、12、18 h后取1 ml培养液,提取DNA,进行RT–PCR检测,并用PCR检测;同时取一环菌液划线接种选择性平板CAS,37 ℃培养18~24 h,挑取CAS上的可疑菌落用API 20E试剂条进行鉴定。

8.市售样本检测:  从北京不同超市及农贸市场,采取16份禽肉样本,编号依次为1~16。各取25 g样本,加入到225 ml的SC增菌液中,37 ℃培养12 h,分别用RT–PCR、PCR和传统分离方法进行沙门菌的检测,比较检测结果。

结果  

1.RT–PCR方法特异性:  15株沙门菌标准株、15株沙门菌分离株检测结果均为阳性;18株非沙门菌检测结果为阴性,说明所建立的RT–PCR方法稳定,特异性好。

2.菌液敏感性实验:  由计数结果可确定原菌液的浓度为5.2×1010 CFU/ml,因此,RT–PCR的模板浓度分别为5.2×1010~5.2×100 CFU/ml,根据实验结果得到相应的Ct值。对于纯菌液,RT–PCR的检测限为5.2×103 CFU/ml,取5.2×1010~5.2×103 CFU/ml的对数值与其检测的Ct平均值做标准曲线,得到Ct=–3.347×log(浓度值) +52.638,其中,R2=0.999, e=0.99,说明标准曲线扩增效率和线性关系良好,各浓度Ct值的标准差≤0.2,计算浓度与给定浓度相比,百分比差率(Var)≤15.08%[Var:计算浓度与给定浓度的百分比差率,Var=Abs (计算浓度/给定浓度–1)×100%;式中Abs为求绝对值函数],说明定量的结果较准确,见图1

图1~6沙门菌系列稀释纯菌液及不同浓度、不同增菌时间的染菌样本RT–PCR扩增图

3.人工染菌实验结果:  由涂布结果可确定原菌液的细菌浓度为1×109 CFU/ ml。这样染菌浓度分别为每25 g样本1、10、102、103、104、105、106CFU。以从不同增菌时间、不同浓度染菌样本提取的细菌DNA为模板,进行沙门菌的RT–PCR反应。由结果可以看出,增菌12 h,最低检出限可以达到1 CFU/25 g,用该时间下的Ct值与初始菌浓度制作标准曲线,得到Ct=–3.284×log(浓度值) + 35.697,即浓度值=10–0.305×Ct+10.870,其中R2=0.995,e=1.02,线性关系较好,根据标准曲线得到的计算浓度和给定浓度相比,Var≤20%,说明定量的准确性较高,图2图3图4图5图6分别为增菌0、4、8、12、18 h扩增结果。
        用SC做选择性增菌,各不同染菌浓度在不同时间点取菌液,传统方法、PCR和RT–PCR方法的检测结果进行比较,见表1。经过增菌,3种方法的检测敏感性都得到很大的提高。传统方法增菌后每25 g最低可检出10 CFU/25 g,用CAS划线分离,最短需要增菌8 h。在增菌8 h内,RT–PCR的敏感性比PCR高10~100倍;增菌12 h以上,RT–PCR和PCR的最低检出限都可以达到1 CFU/25 g。用100~105 CFU/25 g菌浓度的对数值与检测Ct值做标准曲线,发现线性关系良好,可以用于禽肉样本的定量检测。

表1不同时间人工染菌3种方法检出限的比较(CFU/25 g)

4.市售样本的检测结果:  16份样本增菌12 h后采用RT–PCR检测,检出7份沙门菌阳性,样本号分别是5、6、7、8、12、13、14,与PCR检出的阳性份数及阳性编号完全一致。传统方法检出5份阳性,样本号分别是5、7、12、13、14。阳性样本的Ct值对照增菌12 h得到的样本标准曲线浓度值=10–0.305×Ct+10.870,推算25 g样本初始的含菌量。7、13和14号样本的含菌量在1~10 CFU/25 g之间,5、8和12号样本的含菌量在11~100 CFU/25 g之间,6号样本含菌量最高,为106 CFU/25 g。

讨论  采用RT–PCR检测致病菌,可部分弥补传统方法和PCR方法的不足,是目前国际研究的热点。invA在沙门菌中是非常保守的基因,笔者建立了通过invA检测沙门菌的Taqman RT–PCR方法。30株沙门菌均检测为阳性,18株非沙门菌均检测为阴性,说明所建立的方法特异性好。CMCC 50041的纯菌液系列稀释后进行RT–PCR,标准曲线线性关系良好、扩增效率高。该方法最低可以检测到5.2×103 CFU/ml,与既往研究中RT–PCR纯菌液检测敏感性103 CFU /ml在一个数量级上[5,6,7]
        染菌样本经过不同时间增菌后用RT–PCR进行检测,结果显示增菌12 h后,检出限可以达到1 CFU/25 g,和PCR的敏感性一致,比传统方法敏感10倍。已有学者对沙门菌RT–PCR的检出限进行了研究,Cheng等[5]给辣椒粉和虾肉样本染菌后用RT–PCR检测,检出限为0.04 CFU/g;Hein等[4]进行鸡肉等样本的染菌实验,检测限可达到2.5~5.0 CFU/25 g(ml)样本;Perelle等[7]染菌实验中RT–PCR的检出限低于5 CFU/25 g(ml)。上述研究得到的敏感性结论和本实验的结果基本一致,但其大多是在增菌18~24 h后进行的定性检测,没有像笔者这样在不同增菌时间点及大跨度的染菌浓度范围下进行检测。由于RT–PCR比PCR敏感10~100倍,而且沙门菌生长迅速,故只需增菌12 h后检测就可以达到1 CFU/25 g,这比已报道的RT–PCR的检出时间缩短了6~10 h。同时还发现,各浓度样本在增菌12 h后,初始含菌量的对数值和Ct值之间形成了线性关系和扩增效率都较好的标准曲线,可用于样本的定量,这是同类研究中首次建立增菌后样本标准曲线。
        16份禽肉样本,采用RT–PCR检出了7份阳性,与PCR、传统方法的检测结果一致。以往研究没有建立样本标准曲线,故检测食物样本,RT–PCR也只是定性判断。笔者根据样本的Ct值,带入增菌12 h样本标准曲线,可推算出初始含菌量,真正实现定量检测。结果表明,阳性样本的初始含菌量大多并不高,含菌最多的样本为106 CFU/25 g。样本一般较低的含菌量,更提示检测前增菌步骤必不可少。
        禽肉样本经SC增菌12 h后,结合RT–PCR技术检测沙门菌的方法具有快速、简便、敏感、特异等优点,缩短了检出时间,整个流程可以在15 h内完成,适用于食物样本中沙门菌的快速定量检测。

参考文献
[1]DorakMT. Real–time PCR[M]. New York:Taylor & Francis Group, 2006.
[2]KubistaM, AndradeJM, BengtssonM, et al. The real–time polymerase chain reaction[J]. Mol Aspects Med, 2006, 27(2/3):95–125.
[3]黄留玉. PCR最新技术原理、方法及应用[M]. 北京:化学工业出版社, 2005:131–138.
[4]HeinI, FleknaG, KrassnigM, et al. Real–time PCR for the detection of Salmonella spp. in food: an alternative approach to a conventional PCR system suggested by the FOOD–PCR project[J]. J Microbiol Methods, 2006, 66(3):538–547.
[5]ChengCM, LinW, VanKT, et al. Rapid detection of Salmonella in foods using real–time PCR[J]. J Food Prot, 2008, 71(12):2436–2441.
[6]WangL, MustaphaA. EMA–real–time PCR as a reliable method for detection of viable Salmonella in chicken and eggs[J]. J Food Sci, 2010, 75(3):M134–139.
[7]PerelleS, DilasserF, MalomyB, et al. Comparison of PCR–ELISA and LightCycler real–time PCR assays for detecting Salmonella spp.in milk and meat samples[J]. Mol Cell Probes, 2004, 18(6):409–420.