中华预防医学杂志    2016年02期 河南省26例HIV感染长期不进展者病程进展及耐药情况    PDF     文章点击量:4349    
中华预防医学杂志2016年02期
中华医学会主办。
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薛秀娟 田随安 朱谦 孙定勇 王哲
XueXiujuan,TianSuian,ZhuQian,SunDingyong,WangZhe
河南省26例HIV感染长期不进展者病程进展及耐药情况
Detection and analysis of 26 cases of long-term non-progressors who infected HIV in Henan province
中华预防医学杂志, 2016,50(2)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.02.008
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投稿日期: 2015-09-01
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河南省26例HIV感染长期不进展者病程进展及耐药情况
薛秀娟 田随安 朱谦 孙定勇 王哲     
薛秀娟 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心性病艾滋病防治研究所
田随安 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心性病艾滋病防治研究所
朱谦 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心性病艾滋病防治研究所
孙定勇 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心性病艾滋病防治研究所
王哲 450016 郑州,河南省疾病预防控制中心性病艾滋病防治研究所
摘要: 目的  分析河南省HIV感染长期不进展人群3次随访过程中病程进展情况及耐药情况。方法  于2009年5月,选取河南省艾滋病重点疫情地区尉氏、上蔡、临颍县为研究现场,招募26例经既往采供血途径感染HIV、感染时间>10年、未接受抗逆转录病毒治疗、CD4+T淋巴细胞计数≥ 350个/μl并未出现艾滋病典型症状的长期不进展者。采用队列分析方法,自2009年开始每两年随访1次,连续随访3次。收集感染途径、感染时间等流行病学信息。每次随访均采集研究对象10 ml乙二胺四乙酸抗凝全血,共采集78份。分析2009—2014年期间CD4+T淋巴细胞计数、病毒载量、病毒基因的变化情况。采用in-house方法,探讨长期不进展人群的原发耐药状况。采用非参数Kruskal-Wallis检验比较不同随访时间研究对象CD4+T淋巴细胞计数和病毒载量变化。结果  26例研究对象的年龄为(48.51±6.75)岁,感染时间为(13.42±4.26)年。3次随访中,CD4+T淋巴细胞计数的P50 (P75~P25)分别为573.5 (487.4~789.8)、499.8(403.5~635.7)和418.8 (297.6~537.8)个/μl (H=63.99 ,P<0.001),病毒载量自然对数的P50 (P25~P75)分别为3.93 (3.43~4.55)、4.29(3.78~4.75)、4.50(4.01~4.81)(H=3.19,P= 0.355);HIV亚型及系统进化分析显示,感染者以B亚型为主,占88.5%(23/26),3例出现重组变化。18例病毒载量>1 000拷贝/ml的感染者中,有2例出现中高度耐药。结论  河南省长期不进展人群CD4+T淋巴细胞计数有逐年下降的趋势,少数感染者病毒亚型出现重组变化,同时存在原发耐药现象。
关键词 :HIV;抗药性;病毒亚型
Detection and analysis of 26 cases of long-term non-progressors who infected HIV in Henan province
XueXiujuan,TianSuian,ZhuQian,SunDingyong,WangZhe     
Center for AIDS/STD Control and Prevention, Henan Center for Disease Control and Prevention, Zhengzhou 450016, China
Corresponding author: Wang Zhe, Email: wangzhe@hncdc.com.cn
Abstract:Objective  To investigate the progression and drug resistance of long-term non-progressors during three follow-up in Henan province.Methods  In May 2009, 26 cases of long-term non-progressors were recruited who infected HIV more than 10 years with blood collection and supply routes, did not receive anti-retroviral therapy, CD4+T lymphocyte count ≥350/μl and did not show typical symptoms of AIDS from Weishi, Shangcai, and Linying of Henan Province. Continuous follow-up were conducted three times since 2009 every two years with cohort analysis, the epidemiological information of infection routes, infection time and blood were collected, and 78 parts of 10 ml EDTA anticoagulated whole blood were collected. The changes of CD4 + T lymphocytes, viral load, and virus gene variety were characterized from 2009 to 2014. In-house methods were used to explore primary drug resistance of long-term non-progressors. Nonparametric Kruskal-Wallis test were used to compare CD4+ T lymphocyte count and viral load changes during different follow-up times.Results  The average age and infection time of 26 cases were (48.51±6.75) years, (13.42±4.26) years, respectively. Three follow-up times, CD4+ T lymphocyte count P50 (P25-P75) was 573.5 (487.4-789.8), 499.8 (403.5-635.7), and 418.8 (297.6-537.8)/μl (H=63.99,P<0.001), respectively. And natural logarithm of viral load P50 (P25-P75) were 3.93 (3.43-4.55), 4.29 (3.78-4.75), 4.50 (4.01-4.81) (H=3.19,P=0.355), respectively. Subtype and phylogenetic analysis of HIV showed that prevalent cases were B subtype, accounting for 88.5% (23/26), and three cases showed restructuring changes. Two cases appeared highly resistant of 18 infected patients whose viral load >1 000 copies/ml.Conclusion  The CD4+T lymphocyte had a declining trend, virus subtype recombinant changes in a few cases, and primary drug resistance was found of long-term non-progressors in Henan province.
Key words :HIV;Drug resistance;Virus subtype
全文

根据艾滋病病程的进展特征分析,感染HIV 8~10年后,大部分感染者进入艾滋病期需接受抗病毒治疗,仅少部分个体能保持较好状态,CD4+T淋巴细胞维持在正常水平,未出现艾滋病典型症状,病程呈现长期不进展状态[1]。河南省作为我国艾滋病预防控制的重点地区之一,全省流行病学调查发现,目前存在部分于1995年左右因既往采供血途径感染、至今未接受抗病毒治疗的HIV感染者,这部分人群免疫水平较高,病毒载量处于较低水平,为典型的长期不进展人群(long-term nonprogressors,LTNP)[2]。随着感染时间的延长及抗病毒治疗标准的变化[3,4],不断有更多的感染者接受治疗,这部分LTNP数量将不断减少,队列的维持也面临临床治疗的挑战。本研究对部分既往采供血途径感染HIV的LTNP进行连续几年的跟踪随访,通过分析这部分特殊病例的免疫水平和病毒载量整体变化情况,发现病毒的变异进化情况,为HIV感染LTNP形成的机制研究提供参考数据。

对象与方法  

1.对象:  于2009年5月,选取河南省艾滋病重点疫情地区尉氏、上蔡和临颍县为研究场所,按以下纳入标准进行LTNP的招募和建立。LTNP纳入标准:经既往采供血途径感染,HIV确证实验阳性,感染时间>10年,未接受抗病毒治疗,免疫状况较好(CD4+T淋巴细胞计数≥350个/μl),临床未出现艾滋病典型症状,自愿接受调查并签署书面知情同意书。本研究获河南省CDC伦理委员会审核通过(批号:20110415)。

2.CD4+T淋巴细胞计数及病毒载量检测:  采用队列分析方法,自2009年开始每两年随访1次,连续随访3年。收集感染途径、感染时间等流行病学信息。每次随访均采集研究对象10 ml乙二胺四乙酸(eathylene diamine tetraacetic acid ,EDTA)抗凝全血,分离2 ml全血于6 h内采用FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)进行CD4+T淋巴细胞计数检测。其余8 ml以3 000×g离心10 min后分离血浆,使用NucliSens? EasyQ病毒载量试剂盒(法国生物梅里埃公司)进行病毒载量检测,剩余血浆-80 ℃保存备用。

3.PCR扩增:  对26例研究对象3次随访的78份血浆样本进行检测。采用德国QIAGEN公司QIAamp@Viral RNA Mini Kit试剂盒,按试剂盒说明书操作进行血浆病毒RNA的提取和纯化。采用Takara公司(大连宝生物工程有限公司)试剂盒(One Step RNA PCR Kit)进行逆转录PCR扩增HIV毒株gag基因区。第2轮扩增采用Takara公司Premix Ex Taq Version 2.0试剂盒。扩增引物见表1。扩增阳性序列委托北京博迈德生物技术有限公司完成测序工作。

表1HIV毒株gag基因区扩增引物序列

4.HIV毒株亚型及基因进化分析:  利用chromas软件对测序结果进行初步评价,Contig Express软件进行序列拼接和编辑,BioEdit软件用于序列的校对、整理和比对分析。HIV分型参考株序列来自美国Los Alamos国家实验室HIV核酸序列库(Los Alamos HIV database: http://www.hiv.lanl.gov),使用Los Alamos HIV database的HIV-BLAST软件和美国NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)提供的在线分析工具,对获得序列进行在线比对,根据比对结果判定序列所属HIV基因亚型。以Ref.B.TH.90.BK132. AY173951、Ref.B.FR.83.HXB2 LAI IIIB BRU.KO3455、Ref.B.CN.00.671 00T36.AY423387和Ref.08 BC.CN06.OX2.HM067748等4种标准参考株为参照,将得到的HIV毒株gag基因区序列与国内外相近的国际参考株比较,用MEGA 6软件中Neighor-Joining系统进行进化树构建和分析,使用Distance程序进行基因离散率分析。

5.原发耐药分析:  选择第3次随访病毒载量>1 000拷贝/ml的对象,参照文献[5,6,7]的方法进行in-house基因型耐药检测。对测序后的HIV毒株pol基因区扩增片段使用Vector NIT advance 10软件进行序列的编辑及拼接,用BioEdit软件与标准株进行比对和矫正。最终序列提交美国斯坦福大学HIV耐药数据库(http://hivdb.stanford.edu)进行HIV耐药相关突变和耐药性分析。对病毒载量< 1 000拷贝/ml,或病毒载量>1 000拷贝/ml但未检出耐药的研究对象则认为不耐药。

6.统计学分析:  采用SPSS 19.0软件进行数据双录入,核对无误后进行统计学分析。采用非参数Kruskal-Wallis检验比较不同随访时间的CD4+T淋巴细胞计数和病毒载量变化,计算H值。采用方差分析比较3次随访过程中gag基因区离散率的变化。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.基本情况:  26例研究对象的年龄为(48.51±6.75)岁,感染时间为(13.42±4.26)年;男性占65% (17例),女性占35%(9例);感染途径单一,均为既往采样供血途径感染;职业均为农民;高中以上文化程度者占15%(4例),初中/小学及以下者占85% (22例)。

2.CD4+T淋巴细胞计数和病毒载量变化:  26例研究对象3次随访的CD4+T淋巴细胞计数的P50(P25~P75)分别为573.5 (487.4~789.8)、499.8(403.5~635.7)和418.8 (297.6~537.8)个/μl (H=63.99 ,P< 0.001);病毒载量自然对数的P50 (P25~P75)分别为3.93 (3.43~4.55)、4.29(3.78~4.75)、4.50(4.01~4.81) (H=3.19,P=0.355)。

3.HIV毒株gagpol基因区基因扩增和测序情况:  对78份样本进行gag基因区扩增,最终得到70条gag基因区完整序列,扩增效率为89.7%(70/78)。第3次随访检测显示,26例研究对象中有19例病毒载量>1 000拷贝/ml,对该19例研究对象进行pol基因区基因型耐药检测,最终18例样本扩增测序成功。

4.HIV毒株亚型变化及突变位点分析:  应用美国Los Alamos实验室HIV核酸序列库初步对3次随访的亚型分析发现,第1次亚型分析全部为B亚型,第2次随访发生亚型改变的有2例,第3次累计出现5例亚型改变(含之前的2例)。对可疑样本进行重新测序后以排除序列原因,最终发现有3例研究对象发生亚型变化(编号为14, 13, 9)。对以上3例进行网上基因比对分析发现gag基因区出现重组变化,突变区域集中在301~600和201~500 bp位置,突变亚型为CRF08_BC。以国际标准株HXB-2序列为参照,将以上3例样本与HIV Database中的国际参考株进行比对寻找变异位点,结果发现突变区域分别为gag-p17(对照HXB-2位置790~1 186 bp) 1 065~1 073 bp区域插入TACTATTTT序列;gag-p24(对照HXB-2位置1 186~1 879 bp) 1 645~1 649 bp区域CCCAG碱基突变为TGTTT ;1 859~1 871 bp突变前CAGAAT--GCGAA到突变后TAGCTCCCTGCTT。亚型分析显示突变亚型为CRF08_BC。

5.遗传进化分析及基因离散率情况:  3次随访显示,78份样本大多聚集在一起。总体显示以TH_B和CN_B两种亚型为主,少数CRF08_BC亚型(编号为14、13、9)并存。详见图1。基因离散率分析显示,3次随访总体离散率分布为9.6±0.6、9.8±0.4和10.6±0.4(F=0.49 ,P=0.783)。

图1河南省HIV感染长期不进展者3次随访的HIV毒株系统进化分析图(n=26)

6.原发耐药分析:  18例扩增成功的病毒载量>1 000拷贝/ml的研究对象中,有2例出现中高度耐药。其中1例出现对多种核苷类反转录酶抑制剂(NRTIs)耐药的TAMs-1突变,包括M41L、L210W、T215Y和D67N,导致对齐多夫定(zidovudine ,AZT)、司他夫定(Sanilvudin ,d4T)的高度耐药和去羟肌苷(didanosine,DDI)、替诺福韦(tenofovir,TDF)中度耐药。另1例的G190S导致对非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTIs)依非韦伦(efavirentz ,EFV),奈韦拉平(nevirapine,NVP)的高度耐药。

讨论  本研究选择的26例研究对象具有感染时间一致、感染途径相同、感染地区集中等特点,在最大程度上降低了宿主遗传背景等差异对结果分析的影响[8]。CD4 +T淋巴细胞数和病毒载量作为反映研究对象免疫功能水平、监测疾病进程的两个重要实验室检测指标,本研究通过对26例LTNP进行连续随访检测发现,这部分人群在体内病毒控制良好的前提下,CD4+T淋巴细胞绝对计数水平随感染时间的延长有下降趋势,此现象与以往相关调查结论相一致[9]。然而对这部分免疫细胞虽然呈下降水平,但整体维持在增殖与凋亡的动态平衡的感染者抗病毒机制研究有重要意义。后续将进一步加强该人群的定期随访监测,及时发现LTNP的病程进展状况,了解长期生存状况及其影响因素,从现场调查角度为LTNP的致病机制研究提供素材。
        HIV病毒由gagpolenv 3个结构基因组成,由于3个基因片段在结构、功能和保守区域均不相同,在分子生物学分析时对各结构基因片段选择有所区别[10]。为探讨病毒在宿主体内潜伏近20年的变异情况,本研究选择gag基因片段进行亚型分析,以发现LTNP中体内病毒的变化重组情况。结果显示大部分样本序列的同源性很高,系统进化树分析表明各样本3次随访大多聚集在一起,总体以TH_B和CN_B两种亚型为主。回顾性分析可能来源于同一传染源,并且可能存在相互感染现象。对出现亚型改变的3例样本分析显示,变异位点集中在gag-p17和gag-p24基因编码区域,该突变区域与以往报道相一致[11]。然而这种变异与LTNP逃避机体免疫压力的能力及适应性的变化有待进一步研究[12]。由于HIV为逆转录病毒,在整个转录过程中表现出很高的碱基错配频率,高突变率加上病毒的高速复制,随着感染时间的延长导致出现与之前调查不同的结果[13]。然而有研究对异性传播人群体内病毒重组进化分析,发现与之前感染菌株不同的独特的重组形式[14]。而本研究发现的3例重组亚型CRF08_BC,形成原因为病毒本身变异或与其他毒株重组而成,有待进一步调查研究。由于本次亚型分析结果主要与既往的大样本量流调数据进行比较,无法追溯本研究中个体的早期分型依据,影响了对个体数据的综合分析。
        此外对pol基因区进行基因型耐药检测发现2例研究对象出现中高度耐药,这种未治疗人群中存在原发耐药现象在其他调查中也有类似的发现[15]。该结果进一步警醒需要加强治疗前人群的耐药监测,探讨耐药传播的风险因素和目前一线抗病毒治疗存在的隐患,分析其发生原因,为艾滋病预防控制提供参考依据。

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