中华预防医学杂志    2016年02期 1,2-二氯乙烷接触生物监测指标及检测方法研究    PDF     文章点击量:2685    
中华预防医学杂志2016年02期
中华医学会主办。
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周丽屏 邓燕君 刘移民
ZhouLiping,DengYanjun,LiuYimin
1,2-二氯乙烷接触生物监测指标及检测方法研究
Study on biological monitoring indicators of exposure to 1,2-dichloroethane and its determination method in blood
中华预防医学杂志, 2016,50(2)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.02.015
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投稿日期: 2015-03-09
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1,2-二氯乙烷接触生物监测指标及检测方法研究
周丽屏 邓燕君 刘移民     
周丽屏 510620 广州市职业病防治院职业卫生评价检测中心
邓燕君 中山大学公共卫生学院预防医学系
刘移民 510620 广州市职业病防治院职业卫生评价检测中心
摘要: 目的  研究1,2-二氯乙烷(1,2-DCE)染毒处理大鼠血样中1,2-DCE含量与静式染毒柜空气中1,2-DCE的剂量-反应关系,探讨人血样中1,2-DCE作为接触生物监测指标的可行性,建立人血样中1,2-DCE的检测方法。方法  使用静态顶空进样器及气相色谱质谱联用仪测定染毒处理大鼠血样中1,2-DCE含量,采用Pearson相关分析法分析染毒处理大鼠血样中1,2-DCE含量与静式染毒柜空气中1,2-DCE浓度的关系。取15份无接触1, 2-DCE的正常人血样各3.0 ml,分别加入2.0 ml 1,2-DCE标准应用液后马上密封顶空瓶盖,置于静态顶空装置中80 ℃加热平衡20 min,顶空瓶上方蒸汽经毛细管色谱柱分离,选择离子进行定量测定血样中1,2-DCE,并绘制标准工作曲线。分别在1 d及3 d内对人血中1, 2-DCE含量进行6次重复测定,计算相对标准偏差,得出方法批内及批间精密度范围。根据P=(C2-C0)/C1×100%,计算本方法的加标回收率。结果  静式吸入染毒柜内1, 2-DCE浓度为1 472、2 550、3 093、3 976和4 418 mg/m3的剂量组大鼠血样中,1,2-DCE含量均值分别为24.1、231.6、344.3、395.1、538.5 μg/L,与1,2-DCE剂量呈正相关,剂量-反应关系回归方程为y=0.162x-195.8,r值为0.982 2,P=0.003,染毒精密度实验的相对标准偏差范围在7.04%~13.15%。3.0 ml人血样中1,2-DCE在0.259~2 587 μg/L范围内线性关系良好,总体回归方程为y=47 901x-357 446,r值为0.999 8。以人血样中1, 2-DCE质量浓度为0.259 μg/L的样品检测的6次数据计算峰/峰信噪比值均值为56.55,检出限为0.014 μg/L,定量限为0.046 μg/L。批内精密度为1.23%~2.76%,批间精密度为2.21%~4.64%。3.0 ml人血样平均加标回收率为93.3%~98.6%。结论  血中1,2-DCE可作为接触生物监测指标,静态顶空进样器及气相色谱质谱联用仪测定血中1,2-DCE含量灵敏度高、线性范围宽、干扰少、精密度好、操作简单。
关键词 :二氯乙烷类;环境监测;血液;静态顶空进样-气相色谱质谱联用法
Study on biological monitoring indicators of exposure to 1,2-dichloroethane and its determination method in blood
ZhouLiping,DengYanjun,LiuYimin     
Evaluation and Testing Center for Occupational Hygiene, The Hospital of Prevention and Treatment for Occupational Diseases, Guangzhou 510620, China
Corresponding author: Liu Yimin, Email: ymliu61@163.com
Abstract:Objective  To investigate the feasibility of using the concentration of 1,2-DCE in blood as a biological monitoring indicators and build the determination method of 1,2-DCE in blood.Methods  Dose-response relationship of the exposure of 1,2-DCE and the level of 1,2-DCE in rat blood were investigated using the Pearson's correlation analysis. The concentration of 1,2-DCE in blood was determined using Headspace Sampler-Gas Chromatography-Mass Spectrometer (HS-GC-MS). 3.0 ml blood sample diluting with 2.0 ml 1,2-DCE standard serial solution was placed in 15 headspace bottles respectively and heated at 80 ℃ for 20 min.The vapor upon the headspace bottle was separated by capillary column and the concentration of 1,2-DCE was determined by massspectrum in SIM mode to draw a standard work curve. The within-run precision and the between-run precision were calculated by the relative standard deviation (RSD) of the concentration of 1,2-DCE in blood which was determined 6 times in a day and 6 times within 3 days respectively. The recovery rate was calculated by P=(C2 -C0)/C1×100%.Results  When the treatment groups were exposed at dosage of 1 472, 2 550, 3 093, 3 976, and 4 418 mg/m3, the average concentration of 1,2-DCE in rat blood was 24.1,231.6,344.3,395.1,538.5 μg/L. There was a positive correlation between the concentration of 1,2-DCE in rat blood and the exposed level of 1,2-DCE.The equation of dose-response relationship was y=0.162x -195.8,r=0.982 2,P=0.003 and the precision of exposure experiments was 7.04% -13.15%. 1,2-DCE contents within 0.259 -2 587 μg/L showed a good linear relationship and the regression equation was y=47 901x -357 446, r= 0.999 8. When the blood containing 0.259 μg/L 1,2-DCE was determined for six times, the average peak/peak signal-to-noise ratio was 56.55. The limit of detection (LOD) was 0.014 μg/L and the limit of quantification (LOQ) was 0.046 μg/L. The within-run precision was 1.23% -2.76% and the between-run precision was 2.21% -4.64%. The average recovery rate was 93.3% - 98.6%.Conclusion  The concentration of 1,2-DCE in blood could be used as a biological monitoring indicator. The method of the concentration of 1,2-DCE in blood determining by HS-GC-MS was characterized by high sensitivity, wide linear range, small interference, high precision and easy operation.
Key words :Ethylene dichlorides;Environmental monitoring;Blood;HS-GC-MS
全文

1,2-二氯乙烷(1,2-dichloroethane,1,2-DCE)是一种工业上广泛应用的有机溶剂,常温下为无色、易挥发、具有氯仿气味的油状液体,主要用于生产黏合剂、氯乙烯、三氯乙烷、三氯乙烯和四氯乙烯,清除汽油中的铅,清洁纺织品,制造农药。在农业上可用作粮食与谷物的熏蒸剂、土壤消毒剂等[1]。1,2-DCE易燃,属高毒类的神经性毒物,易经呼吸道、消化道和皮肤吸收并快速分布到全身,高浓度接触可引起中毒性脑病,为可疑致癌物[2]。由于黏合剂在玩具、塑料、箱包皮革、制鞋和家具等行业应用广泛,1,2-DCE引起的职业中毒事件时有发生[3,4,5,6]。但目前我国尚未制定1,2-DCE的生物监测指标及生物接触限值,因此其职业中毒诊断缺乏具有代表性的指标。本研究对染毒处理后的大鼠血样中1,2-DCE含量与静式染毒柜空气中1,2-DCE的剂量-反应关系进行分析研究,以期探讨人血样中1,2-DCE作为接触生物监测指标的可行性,并建立人血样中1,2-DCE的检测方法。

材料与方法  

一、材料  

1.实验动物及人血样:  (1)实验动物:采用健康无特定病原体(specific pathogen free,SPF)的6周龄雄性SD大鼠36只,体重范围在180~210 g,由广东省医学实验动物中心提供,检疫合格后对其进行1周的适应性喂养。将实验用大鼠称重后以随机数字法分为6组:阴性对照组、1,2-DCE低剂量组(低剂量精密度实验组)、中剂量组、高剂量组、中剂量精密度实验组、高剂量精密度实验组,每组6只。(2)人血样:无接触1,2-DCE人血样由广州市职业病防治院血液科提供。

2.仪器与试剂:  气相色谱质谱联用仪(6890-5973N,美国Agilent Technologies公司);自动顶空进样器(Headspace sampler turbomatrix 40,美国PerkinElmer公司);DB-5MS毛细管色谱柱(30 m× 0.25 mm×0.25 μm,美国Agilent Technologies公司);超纯水机(Smart 2 Pure,德国TKA公司);万分之一天平(AX200,日本岛津公司);静式吸入染毒柜(8050-3A型,天津合普公司);透明螺纹口顶空瓶(15 ml,德国CNW公司);1, 2-DCE(纯度≥99.5%,德国Dr.Ehrensorfer公司);乌拉坦(纯度≥98%,天津市光复精细化工研究所)。

3.1, 2-DCE标准储备液:  准确称取1, 2-DCE 0.0194 g置于50 ml容量瓶中,实验用一级水定容,制备得到质量浓度为0.388 mg/ml的标准储备液,-4 ℃保存。临用前稀释成质量浓度为3 880、1 940、970、776、388、194、77.6、38.8、19.4、11.6、7.76、3.88、1.55、0.776、0.388 μg/L的标准应用液。

二、实验方法  

1.染毒方法:  将大鼠放入静式吸入染毒柜内,选择静式吸入染毒柜内1, 2-DCE浓度为1 472、2 550和4 418 mg/m3作为低、中、高剂量组,另选择浓度为1 472、3 093和3 976 mg/m3作为低、中、高剂量精密度实验组,每天6 h,连续染毒5 d,染毒期间每30 min监测一次染毒柜内1, 2-DCE浓度。染毒柜体积为60 L,每个染毒柜加入2只大鼠,每2 h打开染毒柜盖子更换染毒柜内空气,染毒时大鼠禁水禁食。阴性对照组除不加1, 2-DCE外,其他条件同低、中、高剂量组,染毒期间观察大鼠行为变化。

2.血样采集和保存:  大鼠染毒结束后,观察8 h,用质量分数为25%的乌拉坦0.5 ml/100 g腹腔注射麻醉,取腹主动脉血3 ml于肝素钠抗凝采血管中。血样密封后于4 ℃冰箱中保存,尽快测定,如需长期保存,则存放于-20 ℃冰箱中。

3.实验条件:  (1)顶空条件:顶空平衡温度80 ℃;取样针温度90 ℃;传输线温度100 ℃;加压时间2 min;进样时间0.04 min;拔针时间0.2 min;恒温平衡时间20 min;色谱柱压力15.0 psi;样品瓶压力15.0 psi。(2)色谱条件:进样口温度250 ℃;柱温40 ℃,保持3 min,再以20 ℃/min升到100 ℃,保持1 min;以5∶1的分流比进样,载气使用高纯氦气,柱流量为0.8 ml/min。(3)质谱条件:离子源为电子轰击源,离子源温度为230 ℃,辅助接口温度为280 ℃,电子轰击源电压为69.9 eV,扫描方式为SIM,SIM参数:62.0质荷比(m/z),质谱调谐设置为自动调谐。

4.SD大鼠血样中1, 2-DCE浓度测定:  将待检血样充分摇匀,准确移取3.0 ml血样于15 ml顶空瓶中,加入2.0 ml一级水后马上密封顶空瓶盖,按照上述实验条件测定SD大鼠血中1, 2-DCE的浓度。

5.顶空平衡温度实验:  取15份无接触1, 2-DCE的正常人血样各3.0 ml分别置于15 ml顶空瓶中,分别加入2 ml 38.8 μg/L的1, 2-DCE标准应用液后,马上密封顶空瓶盖,配制成质量浓度为25.9 μg/L的平行血样。取其中8份分别在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃条件下平衡20 min后进样分析。

6.恒温平衡时间实验:  取上述剩余7份血样,分别在顶空平衡温度80 ℃的条件下对样品进行恒温平衡时间为2、5、8、12、15、20、30 min的研究,通过恒温时间-峰面积测定数据绘制对应曲线图。在恒温条件下,色谱测定的峰面积基本不变时的最短的时间间隔就是最佳顶空平衡时间。

7.标准工作曲线绘制:  另取15份无接触1,2-DCE的正常人血样各3.0 ml,分别置于15 ml顶空瓶中,分别加入2.0 ml 1, 2-DCE标准应用液后马上密封顶空瓶盖,配制成质量浓度为高(258.7、517.3、646.7、1 293.3、2 586.7 μg/L)、中(7.76、12.9、25.9、51.7、129.3 μg/L)、低(0.00、0.259、0.517、1.034、2.59、5.17 μg/L) 3个标准系列。标准系列血样置于自动顶空进样器中恒温平衡20 min,进入气相色谱质谱联用仪进行分析,以SIM模式扫描,选择采集质荷比为62.0的离子,以峰面积的均值对1, 2-DCE的质量浓度绘制标准曲线。

8.检出限及定量限:  方法检出限根据LOD=3× Q×N/I(公式1)计算所得,定量限根据LOQ=10×Q× N/I(公式2)计算所得,式中Q为进样量(μg/L) ;N为噪声;I为信号响应值,I/N即为该进样量下的信噪比。本实验信噪比值可通过工作站对图谱进行自动分析获得。本研究采用峰/峰信噪比值进行计算,由于信噪比的计算结果与所取的噪声位置、基线长度有很大的关系,为避免信噪比值的计算波动,本研究以血样中1, 2-DCE质量浓度为0.259 μg/L的样品检测的6次数据计算信噪比的平均值。

9.精密度实验:  取72份无接触1, 2-DCE的正常人血样各3.0 ml,分别置于15 ml顶空瓶中,把72个顶空瓶分成6组,每组12瓶,各组中分别加入2.0 ml 1.55、19.4、38.8、77.6、388和1 940 μg/L 1, 2-DCE标准应用液,配制成加标质量浓度分别为1.03、12.9、25.9、51.7、259和1 293 μg/L的样品。在1 d内进行6次重复测定,计算相对标准偏差,作为方法批内精密度;在3 d内进行6次重复测定,计算相对标准偏差,作为方法批间精密度。

10.加标回收实验:  另取36份无接触1, 2-DCE的正常人血样各3.0 ml,分别置于15 ml顶空瓶中,把36个顶空瓶分成6组,每组6瓶,各组中分别加入2.0 ml 1.55、19.4、38.8、77.6、388和1 940 μg/L 1, 2-DCE标准应用液,配制成加标质量浓度分别为1.03、12.9、25.9、51.7、259和1 293 μg/L的样品。加标回收率根据P= (C2-C0)/C1×100%计算所得,式中C0为空白人血样中1, 2-DCE的浓度(μg/L);C1为加标浓度(μg/L);C2为加标血样中1, 2-DCE的浓度(μg/L)。

三、统计学分析  数据录入采用Excel 2003软件,核对无误后导入Origin Pro 8.0软件进行统计分析。采用Pearson相关分析法分析染毒处理大鼠血液样中1, 2-DCE含量与静式染毒柜中1, 2-DCE浓度的关系。以P< 0.05为差异有统计学意义。

结果  

一、剂量-反应关系  染毒柜中1, 2-DCE浓度为1 472、2 550、3 093、3 976、4 417 mg/m3所对应的大鼠血样中1, 2-DCE含量均值分别为24.1、231.6、344.3、395.1、538.5 μg/L。Pearson相关分析结果显示,剂量-反应关系回归方程为y=0.162x-195.8 ,r=0.982 2 ,P=0.003。提示,SD大鼠血样中1, 2-DCE含量与染毒剂量呈正相关关系。染毒精密度实验结果显示,低剂量精密度实验组大鼠血中1, 2-DCE含量的相对标准偏差为13.15%;中剂量精密度实验组大鼠血中1, 2-DCE含量的相对标准偏差为9.99%;高剂量精密度实验组大鼠血中1, 2-DCE含量的相对标准偏差为7.04%。相对标准偏差范围在7.04%~13.15%,可见染毒实验重现性较好。

二、无接触1, 2-DCE人血样顶空处理结果  

1.血样预处理结果:  本研究显示,3.0 ml血样加入2.0 ml水时实验结果较佳,此时样品总量占整个顶空瓶的35%空间(最佳推荐用量),样品黏度适中,不易受热变性凝固。

2.顶空平衡温度:  如图1所示,在温度较低时,1, 2-DCE的响应值较低,在35~80℃之间,随着温度的升高,1, 2-DCE的峰面积不断增大,检测灵敏度不断提高,因此本研究采用80 ℃作为最佳平衡温度。

图1平衡温度-峰面积关系曲线

3.恒温平衡时间:  如图2所示,当恒温平衡时间为15 min时,1, 2-DCE峰面积变化趋于平缓,在20 min后,顶空瓶中血样与顶空瓶上方气体达到平衡,因此最佳恒温平衡时间为20 min。

图2平衡时间-峰面积关系曲线

三、线性范围及检出限  工作曲线在高、中、低3个标准系列中均有良好线性关系,详见表1。方法信噪比值均值为56.55,代入公式1,计算得出方法检出限为0.014 μg/L,代入公式2计算得出定量限为0.046 μg/L。

表1人血样中1, 2-DCE线性范围、回归方程、相关系数(n=3)

四、精密度、加标回收率实验结果  方法批内精密度范围为1.23%~2.76%,批间精密度范围为2.21%~4.64%。本方法的平均加标回收率范围为93.3%~98.6%。详见表2

表2方法的精密度、加标回收率实验结果(n=6)

讨论  虽然已有1, 2-DCE接触者尿液中生物指标监测的研究报道[7],但由于暴露组的尿样中多出现硫代二乙酸二甲酯、2-甲硫基乙酸甲酯、磷酸三甲酯等多种组分,没有唯一性及明显的特异性,因此尿中代谢物作为1, 2-DCE接触生物标志物的研究仍需进行大量的实验和研究探索,而本研究选择血中1, 2-DCE作为接触生物监测指标具有唯一性。本研究通过动物染毒实验证实,大鼠从呼吸道吸入1, 2-DCE能通过循环进入体内血液系统,染毒大鼠血液中1, 2-DCE浓度与染毒剂量呈正相关关系,且染毒实验重现性较好,提示血中1, 2-DCE可作为接触生物监测指标之一。
        静态顶空技术是将样品置入一密闭容器中,通过加热使挥发性组分与样品基体达到气液(或气固)两相平衡,其顶部气体在一定的条件下成分相对固定[8]。本研究材料为血样,由于血样中其他挥发性物质较少,而待测物1, 2-DCE是易挥发有机物,能满足静态顶空的样品要求。根据谢玉璇等[9]报道的气相色谱-质谱法测定血中1, 2-DCE的检测方法,其顶空温度在30~60 ℃时,样品峰面积随平衡温度增加而增加,60 ℃后响应值不升反降,其原因就是因为血液本身凝固。因此,本研究在对血样进行前处理时,以3.0 ml血样加入2.0 ml水为最佳条件,避免血液在较高温度下变性凝固。
        从平衡温度-峰面积关系曲线来看,顶空体系温度升高可提高检测灵敏度,但当温度升高,顶空瓶内压力增大,容易导致取样时垫片周围漏气,体系容易出现沸腾现象,破坏了体系两相平衡,从而导致重现性变差。其次,当平衡温度较高时,顶空瓶内水蒸汽较多,进入DB-5MS色谱柱后,容易造成较大的柱流失,降低柱效,缩短色谱柱寿命。
        由于本方法采用质谱SIM模式进行定量分析,样品干扰少,峰面积从105~1012时均有较好的峰形,因此本方法线性范围较宽,可达5~6个数量级,但考虑到一般人群中接触1, 2-DCE的浓度较低,时间较短,除部分急性中毒患者外,一般接触人群关注较低浓度范围。因此本方法工作曲线范围可根据具体样品的浓度水平确定。
        本研究采用静态顶空进样-气相色谱质谱联用法测定血中1, 2-DCE含量,得到批内和批间精密度均<5.0%,此实验的良好精密度是建立在顶空装置的良好性能基础上的。该方法对仪器设备要求较高,若无全自动顶空装置,很难实现方法的高灵敏度、良好线性及良好重现性。

参考文献
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