中华预防医学杂志    2016年03期 杭州市急性呼吸道感染婴幼儿中副流感病毒3型遗传进化及其感染特征研究    PDF     文章点击量:2944    
中华预防医学杂志2016年03期
中华医学会主办。
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钱昕 于新芬 赵敏 寇宇 李钧 周银燕
QianXin,YuXinfen,ZhaoMin,KouYu,LiJun,ZhouYinyan
杭州市急性呼吸道感染婴幼儿中副流感病毒3型遗传进化及其感染特征研究
Analysis of pathogenic features and infection status of human parainfluenza virus type 3 among children in Hangzhou
中华预防医学杂志, 2016,50(3)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.03.013
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投稿日期: 2015-05-20
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杭州市急性呼吸道感染婴幼儿中副流感病毒3型遗传进化及其感染特征研究
钱昕 于新芬 赵敏 寇宇 李钧 周银燕     
钱昕 310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科
于新芬 310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科
赵敏 杭州市儿童医院监察室
寇宇 310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科
李钧 310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科
周银燕 310021 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科
摘要: 目的  分析杭州市婴幼儿中副流感病毒3型(HPIV-3)的遗传进化及其感染与合并感染情况。方法  收集2009年12月至2013年3月杭州地区医院0~11岁婴幼儿急性呼吸道感染病例咽拭子或呼吸道吸出物样本,共856份(男性553例,女性303例)。采用逆转录荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测HPIV-3,阳性样本用特异性引物扩增HN基因进行基因测序,将测序所得序列用Clustal X 2.0软件进行比对,然后使用MEGA 6.0软件,采用邻接法建立系统进化树。同时,用qRT-PCR法检测与其他呼吸道病原体的合并感染情况。采用χ2检验比较不同特征患儿单一感染与合并感染情况。结果  856例患儿中,HPIV-3阳性84例(9.6%)。男性患儿HPIV-3感染阳性率为10.0%(55/553),女性患儿阳性率为9.6%(29/303)(χ2=0.03,P=0.860)。84例HPIV-3阳性病例的合并感染率为49%(41例),其中与鼻病毒合并感染检出率较高,为41%(17例);1岁以下患儿的合并感染率为54%(36/67),高于单一感染率[46%(31/67)](χ2=4.78,P=0.029);单一感染患儿伴有肺炎症状占93%(37/40),高于合并感染组[76%(29/38)](χ2=3.92,P=0.048)。同源性分析结果显示,56例患儿HPIV-3的HN基因编码区核苷酸和氨基酸序列一致性均较高,一致性分别为96.9%~100.0%和98.6%~100%。基于HN基因的进化树分析表明,杭州株均归属于C3亚群。结论  杭州市婴幼儿的急性呼吸道感染与HPIV-3有关;HPIV-3 HN基因型变异较小,但进化具有一定地域特征;与其他呼吸道病毒的合并感染率较高。
关键词 :副流感病毒3型,人;感染;遗传
Analysis of pathogenic features and infection status of human parainfluenza virus type 3 among children in Hangzhou
QianXin,YuXinfen,ZhaoMin,KouYu,LiJun,ZhouYinyan     
Microbiology Laboratory, Hangzhou Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310021, China
Corresponding author: Yu Xinfen, Email: yuxin-fen@163.com
Abstract:Objective  To determine the level of genetic variation of human parainfluenza virus type 3 (HPIV-3), and to describe infection and co-infection characteristics of HPIV-3 in children.Methods  Single respiratory samples from 856 pediatric patients with acute respiratory tract infection (ARI) in Hangzhou were collected from December 2009 to March 2013. All samples were screened for HPIV-3 by real-time RT-PCR and followed by HN sequencing and phylogenetic analysis. In all RSV positive specimens, we screened for the other pathogens, and co-infection characteristics were evaluated.Results  A total of 9.6% of 856 samples were positive for HPIV-3, the nucleotide among the strains ranged from 96.9% to 100%. All Hangzhou strains were placed in C3 subgroup based on HN gene analysis. 49% (n=41) of all HPIV-3-positive children with ARI were found to be co-infected with at least one of the other pathogen. The highest co-infection rate of HPIV-3 was with HRV (n=17). Children in the younger groups (≤12 months old) were significantly more prone to be co-infected with other pathogen (χ2=4.78, P=0.029). Pneumonia infection rate was significantly higher in the mono-infection group than the co-infection group (χ2=3.92, P=0.048).Conclusion  HPIV-3 was an important pathogen in children with ARI in Hangzhou. HN gene variation rate was low, but showed a more local pattern. The co-infections with other respiratory viruses were popular. Except for pneumonia, no significant differences in other clinical presentation between the HPIV-3 mono-infection and co-infection groups were observed.
Key words :Parainfluenza virus 3, human;Infection;Heredity
全文

人类副流感病毒(human parainfluenza virus, HPIV)是能够感染各年龄组人群的常见呼吸道病毒病原,属副黏病毒科副黏病毒亚科,基因全长约15 000个核苷酸,是有包膜的负链RNA病毒。根据病毒抗原性和遗传性的不同,可分为4个血清型(HPIV-1~HPIV-4),HPIV-1和HPIV-3属于呼吸道病毒属,HPIV-2和HPIV-4属于腮腺炎病毒属。流行病学研究发现,几乎所有的儿童都至少一次感染过HPIV,而进一步的血清学研究发现,大约60%的2岁以下儿童或80%的4岁以下儿童曾经感染HPIV-3[1]。HPIV-3引起的呼吸道疾病常发生于1岁以下的婴儿,是仅次于呼吸道合胞病毒感染引起婴儿支气管炎和肺炎的重要病原体,是导致婴儿和低龄儿童高发病率和死亡率的主要原因之一[2,3]
        HPIV-3包膜表面存在两种糖蛋白,血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)和融合蛋白(fusion protein,F)。其中HN蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性,调节病毒吸附和穿入宿主细胞的全过程。此外,HN蛋白还具有HPIV-3主要抗原的功能,是HPIV-3中抗原变异和基因变异的最大的蛋白[4],因此HPIV-3 HN基因的序列分析被认为是监测HPIV-3疾病暴发的有效方法。国内外对HPIV-3的流行情况,尤其是对HPIV-3的合并感染特征报道较少。本研究对2009年12月至2013年2月杭州地区部分婴幼儿急性呼吸道感染病例进行HPIV-3的检测,分析其感染和合并感染特征,并对其HN基因进行了测序及遗传进化分析。

材料与方法  

1.材料:  收集2009年12月至2013年3月杭州地区医院0~11岁急性呼吸道感染病例样本,共856份(男性553例,女性303例)。其中2009年11月至2010年1月,每周于杭州市各医院(浙江大学医学院附属儿童医院、浙江省东方医院、杭州市一医院)儿科门诊采集急性呼吸道急性感染病例样本共计171份,均为咽拭子;2011年3月至2013年3月,每周于浙江大学医学院附属儿童医院采集急性呼吸道急性感染住院病例样本共计685份,均为呼吸道吸出物。所有样本采集后送杭州市CDC实验室,于-80 ℃冰箱存放。

2.病毒核酸提取:  使用德国Qiagen公司生产的DNA试剂盒(DNA mini kit)提取病原体DNA,使用德国Qiagen公司生产的RNA试剂盒(RNeasy mini kit)提取病毒RNA。实验操作步骤严格按说明进行。最后将核酸溶解于50 μl双蒸水中。cDNA合成反应采用日本Takara公司生产的试剂盒(PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit),按照说明书操作,逆转录引物为5'-AGCAAAAGCAGG-3'。

3.HPIV-3检测:  HPIV-3的检测参考Raymond等[5]的方法,通过逆转录荧光定量PCR(qRT-PCR)法在ABI7500上进行,引物序列见表1。25 μl体系中加入1 μl cDNA作为模板。PCR反应条件为50 ℃ 2 min,95 ℃预变性2 min,95 ℃变性15 s,50 ℃退火15 s,60 ℃延伸40 s,45个循环。

表1不同类型PCR使用的引物序列及产物长度

4.阳性病例样本常见呼吸道病毒及肺炎支原体和衣原体的筛检:  对HPIV-3阳性样本进行了呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、鼻病毒(rhinovirus,HRV)、流感病毒(influenza virus,IV)、腺病毒(adenovirus,ADV)、Saffold病毒、HPIV-1和HPIV-2、人类冠状病毒(human coronavirus,HCoV)(HKU1、OC43、229E、NL63),人类偏肺病毒(human metapneumovirus,HMPV),人类博卡病毒(human bocavirus,HBoV),肺炎支原体(M.pneumonia,MPP),肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae,CPP)的检测[5,6,7]

5.HN基因检测及序列测定:  HN基因全长1 719 bp,设计引物扩增长度为1 960 bp,引物序列见表1,由生工生物(上海)有限公司合成。扩增体系为:2.5 μl 10×LA PCR缓冲液、4 μl 10 mmol dNTP、20 μmol正反向引物各0.25和2 μl逆转录产物和0.25 μl 5 U/μl的LA Taq酶(日本Takara公司),并用双蒸水补足体积至25 μl。反应条件为94 ℃预变性5 min后,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2.5 min,35个循环,最后72 ℃延伸6 min。PCR扩增阳性产物送生工生物(上海)有限公司进行测序。对测序结果进行拼接,得到HPIV-3 HN基因全长序列。

6.进化树分析:  将测序所得序列用Clustal X 2.0进行比对,然后使用MEGA 6.0软件,采用邻接法(Neighbor-joining,NJ)方法,用Bootstrap程序进行1 000次重复计算来建立系统进化树。

7.统计学分析:  采用SPSS 17.0软件进行平行录入,核对无误后进行统计学分析。采用χ2检验比较不同特征患儿单一感染和合并感染差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.HPIV-3的检出情况:  856例患儿中,HPIV-3阳性84例(9.6%)。男性患儿HPIV-3感染阳性率为10.0%(55/553),女性患儿阳性率为9.6%(29/303)(χ2=0.03,P=0.860)。HPIV-3感染阳性患儿年龄最小1月龄,最大11岁。其中,<1岁患儿阳性率为10.5%(68/645),1~3岁患儿阳性率为8.8%(10/114),3~6岁患儿阳性率为8%(5/65),6岁以上患儿阳性率为3%(1/32),差异无统计学意义(Fisher确切概率法,P=0.581)。

2.HPIV-3合并感染情况分析:  84例HPIV-3阳性病例的合并感染率为49%(41/84)。HPIV-3与1种病原体合并感染31例,与2种病原体合并感染9例,与3种病原体合并感染1例,与流感病毒未发现合并感染的情况。与HPIV-3合并感染较多的为HRV,共17例,其次是RSV和Saffold,各8例,HPIV-3的具体合并感染情况见表2。男性患儿合并感染率为42%(23/55),女性患儿合并感染率为62%(18/29)(χ2=3.12,P=0.078)。<1岁患儿合并感染率为54%(37/68),≥1岁患儿合并感染率为25%(4/16)(χ2=4.48,P=0.034)。

表2杭州市副流感病毒3型阳性患儿与其他病毒合并感染情况

3.HPIV-3感染的临床特征:  84例感染HPIV-3的患儿中,其中78例具有完整的病例资料。单一感染的40例,存在合并感染38例。1岁以下患儿单一感染率为46%(31/67),合并感染率为54%(36/67)(χ2=4.78,P=0.029)。咳嗽、发热和呼吸困难为常见的临床表现。67例患儿X线表现为肺部异常,但在单一感染和合并感染两组间的差异无统计学意义。肺炎是较常见的并发症,而单一感染组的肺炎发病率高于合并感染组(P=0.048)。详见表3

表3杭州市单一与合并感染副流感病毒3型患儿的临床特征比较

4.序列分析:  84例患儿中,56例患儿的样本测序成功。PCR扩增HN基因进行核苷酸序列分析。HN基因编码区全长1 719 bp,编码573个氨基酸。同源性分析结果显示,56例患儿样本HPIV-3的HN基因编码区核苷酸和氨基酸序列一致性都很高,一致性分别为96.9%~100.0%和98.6%~100%。将56份序列提交至GenBank,获得登录号KP690739-KP690794。

5.基因进化分析:  从GenBank选取了6个国家(包括美国、沙特阿拉伯、中国、印度、日本、澳大利亚)共21株HPIV3作为参考株,选取本研究中22株差异较大菌株的测序结果构建HN基因进化树。详见图1。HN基因可被分为A、B、C 3个进化簇,C群又进一步分亚群。C群之间的核酸序列一致性为95.0%~100%。所有杭州地区的HPIV-3的HN基因都属于C3亚群,中国株包括上海株、北京株、兰州株和广州株也均在C3亚群。C3亚群以大于2.0%的核苷酸差异又进一步分为3个进化分支,4株杭州株和2株2009年北京株属于C3b株系,18株杭州株、2株上海株、1株北京株、1株兰州株和1株广州株均属于C3a株系,另有1株2009年分离的美国株和2008年分离的沙特阿拉伯株属于C3x株系。参考株中的中国株与杭州株的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为96.6%~99.8%和98.4%~99.8%。与杭州株遗传进化关系最远的是B群中的日本株AB012132,与杭州株的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为91.9%~93.1%和93.7%~94.6%。HPIV-3的HN基因遗传进化分析提示,HPIV-3进化具有较明显的地域特征。

图1杭州市22株副流感病毒3型分离株基于21株血凝素-神经氨酸酶基因参考株的系统进化树
杭州HPIV-3分离株与原型株M17641 HN基因相比,共有33个氨基酸发生了改变,核苷酸的变异均为散在点突变,无插入、缺失和移码突变。选取部分杭州株与原型株氨基酸变异位点进行了比较。详见表4
表4杭州市副流感病毒3型分离株与原型株血凝素-神经氨酸酶基因氨基酸变异位点比较

讨论  HPIV-3是导致婴幼儿以及免疫低下人群下呼吸道感染的主要病因之一。本研究对杭州856例急性呼吸道感染病例进行了HPIV-3的检测,阳性检出率为9.6%,高于赵林清等[8]2007年北京的检出率(5.1%)和季伟等[9]2011年报道的苏州的检出率(2.7%);低于胡燕等[10]2014年报道的上海的检出率(14.0%)和Mao等[11]2012年北京的检出率(13.1%)。检出率的不同可能与样本类型、样本分布季节及地区差异等有一定关系。
        本研究中HPIV-3患儿具有较高的合并感染率(48.8%),≤1岁患儿的合并感染率高于>1岁患儿,两组差异具有统计学意义。这可能与婴儿免疫系统不完善有关,提示1岁以下婴幼儿治疗时应警惕医院内感染。HPIV-3与其他呼吸道病毒的相互作用机制目前还不明确。多病毒合并感染对临床的意义目前也是有争议的。一些研究表明多病毒合并感染可以增加疾病的严重程度[12,13],而另一些研究却得出相反的结论[14]。这与采样人群、临床情况、病毒的流行季节性甚至与细菌的合并感染等有关。本研究中HPIV-3单一感染组的肺炎发病率显著高于合并感染组。
        HPIV-3的HN基因分为A、B、C 3个进化簇。A、B进化簇的分离株均来自于20世纪。其中AB012132分离自日本,目前已不再流行。从进化树中也可以看出,目前杭州流行的HPIV-3株与中国来源的参考株同属于C3a和C3b进化分支,美国株(JF912197)和沙特阿拉伯株(JX131647)则属于C3的另一个进化分支,提示HPIV-3的进化具有一定地域性特征,与胡燕等[10]的研究结果一致。
        杭州分离株之间HN基因高度同源,氨基酸变异的频率较低。发现的所有突变均为点突变,随机分布于HN基因的整个编码区。同源性重组也是导致HPIV-3 HN基因多样性的另一重要原因[15],但在本次研究中并未发现。HPIV-3 HN基因编码区存在HN活性和受体结合相关的7个氨基酸的活化/催化位点(192、424、502、530、409、549和216)[16],是调节病毒吸附和穿入宿主细胞的重要位点,本研究样本中并未在以上位点发生突变,从分子生物学层面表明杭州HPIV-3在杭州的流行是比较稳定的散发状态。上海分离株HN蛋白除了第2位氨基酸外,其余氨基酸的突变在杭州地区也都存在,与其他研究中发现的变异位点也具有一定相似性[10,15,17]。但是否存在某些突变频率较高的氨基酸位点,从而对病毒的感染和传播过程造成影响仍需要进一步的监测和研究。
        综上所述,HPIV-3是杭州地区婴幼儿急性呼吸道感染的重要病原之一。与流感等其他呼吸道病毒相比,HPIV-3的HN基因相对保守,但已知的分子进化信息较少。除了单一感染组的肺炎发病率显著高于合并感染组,单一和合并感染组在其他临床表现上没有显著性差异。HPIV-3遗传进化及其感染特征研究对HPIV-3的监测、预防和控制具有重要的指导意义。

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