中华预防医学杂志    2016年03期 Toll样受体7在肠道病毒71型感染人Jurkat T细胞诱导炎症因子中的作用    PDF     文章点击量:2729    
中华预防医学杂志2016年03期
中华医学会主办。
0

文章信息

茌静 何雅青 余光清 雷蕾
ChiJing,HeYaqing,YuGuangqing,LeiLei
Toll样受体7在肠道病毒71型感染人Jurkat T细胞诱导炎症因子中的作用
Role of Toll-like receptor 7 in the production of inflammatory cytokines in EV-A71-infected human Jurkat T cells
中华预防医学杂志, 2016,50(3)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.03.015
引用本文:

文章历史

投稿日期: 2015-05-25
上一篇:2011—2013年河南省肠炎沙门菌耐药与分子分型研究
下一篇:纳米金信号放大石英晶体微天平快速检测己烯雌酚
Toll样受体7在肠道病毒71型感染人Jurkat T细胞诱导炎症因子中的作用
茌静 何雅青 余光清 雷蕾     
茌静 518101 深圳市宝安区疾病预防控制中心微生物检验科
何雅青 深圳市疾病预防控制中心微生物检验科
余光清 518101 深圳市宝安区疾病预防控制中心微生物检验科
雷蕾 518101 深圳市宝安区疾病预防控制中心微生物检验科
摘要: 目的  研究Toll样受体(TLRs)在肠道病毒71型(EV-A71)感染人T细胞中的表达情况,阐明其在EV-A71致炎症反应机制中的作用。方法  EV-A71毒株由深圳市CDC于2014年从手足口病患儿粪便中分离,接种200 μl病毒滴度为103细胞培养半数感染量(CCID50)/ml的病毒液于人Jurkat T细胞,不同感染时间后,采用RT-PCR方法检测TLR1~TLR10 mRNA表达情况;采用Real-time PCR分析TLR7 mRNA变化水平;采用Western blot分析TLR7相关接头分子髓样分化因子(MyD88)表达水平;采用ELISA检测培养上清细胞因子白细胞介素(IL)-6、IL-8和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌水平。结果  Real-time PCR检测结果显示,感染6、12、24和48 h,感染组TLR7 mRNA的相对表达水平分别为1.26±0.15、1.75±0.20、2.26±0.23和3.74±0.62,与对照组差异有统计学意义(t值分别为-2.96、-6.38、-9.57、-7.71,P值均<0.05);Western blot结果显示,感染24 h和48 h时,感染组MyD88蛋白表达水平与对照组相比分别增加1.34和2.17倍;细胞因子检测结果显示,感染24 h和48 h时,IL-6的分泌水平分别为(302.86±38.11)、(179.70±14.50)pg/ml,高于对照组24 h和48 h的分泌水平[(176.42±9.60)、(179.70±14.50)pg/ml],差异有统计学意义(t值分别为-5.57、-18.54,P值均<0.05)。48 h感染组TNF-α分泌水平为(100.81±9.81)pg/ml,高于对照组[(56.19±6.94)pg/ml],差异有统计学意义(t=-6.43,P=0.003)。结论  EV-A71主要通过TLR7被免疫活性细胞识别,进而激活TLR7相关信号通路,诱导产生大量促炎因子来参与感染致炎症反应的病理过程。
关键词 :肠道病毒71型;Toll样受体;人Jurkat T细胞;细胞因子
Role of Toll-like receptor 7 in the production of inflammatory cytokines in EV-A71-infected human Jurkat T cells
ChiJing,HeYaqing,YuGuangqing,LeiLei     
Department of Microbiological Laboratory, Baoan Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen 518101, China
Corresponding author: Chi Jing, Email: chijing0905@163.com
Abstract:Objective  To investigate the expression of Toll-like receptor (TLR) mRNA in enterovirus 71(EV-A71) infected human Jurkat T cells and clarify the role of TLRs in the pathogenesis of EV-A71 infection-induced inflammation.Methods  EV-A71 strains were isolated from feces of children patients with hand, foot and mouth disease in 2014 by Shenzhen Center for Disease Control and Prevention. Human Jurkat T cells were infected with 200 μl EV-A71 at 103 cell culture infective dose 50%(CCID50)/ml. The expression of TLR1-TLR10 mRNA in human Jurkat T cells was assessed at different exposure time by RT-PCR. Levels of TLR7 mRNA expression were detected by real-time PCR, and levels of myeloid differentiation factor 88 (MyD88) by western blot. The cytokine secretion of interleukin (IL)-6, IL-8 and Tumor Necrosis Factor α (TNF-α) was analyzed by ELISA assay.Results  The relative expression level of TLR7 mRNA in human Jurkat T cells were 1.26±0.15, 1.75±0.20, 2.26±0.23 and 3.74±0.62 in 6, 12, 24 and 48 h after EV-A71 infection, which the differences were significant with mock-infected group(t values were -2.96, -6.38, -9.57, -7.71; P<0.05). Western blot showed that the protein expression levels of MyD88 had increased 1.34 times and 2.17 times in 24 h and 48 h after EV-A71 infection compared with mock-infected group. After infected for 24 h and 48 h, the levels of IL-6 were (302.86±38.11), (179.70±14.50) pg/ml, which were significantly higher than mock-infected group (176.42±9.60), (179.70±14.50) pg/ml (t values were -5.57, -18.54, P<0.05). The levels of TNF-α in EV-A71 infected group (100.81±9.81) pg/ml was higher than that in mock-infected group (56.19±6.94) pg/ml, and the difference was significant (t=-6.43, P=0.003).Conclusion  TLR7 is the main pattern recognition receptor responsible for EV-A71 recognition in immune cells, which then leads to the activation of TLR7 downstream signaling and the production of proinflammatory cytokines.
Key words :Enterovirus 71;Toll-like receptors;Human Jurkat cells;Cytokines
全文

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71)是导致婴幼儿手足口病的主要病原体,也是引起我国手足口病重症和死亡病例的优势病原[1]。重症手足口病,尤其是EV-A71感染的手足口病,发病机制可能与感染后细胞因子风暴导致全身炎症反应综合征有关[2]
        Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是主要的模式识别分子,表达于单核巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞、小胶质细胞等多种细胞。TLR1~ TLR10在人体抗感染免疫中发挥着重要作用,它们与相应的病原相关模式分子结合后构象发生改变,进而激活相关信号传导通路,启动天然免疫,从而诱导炎性细胞因子/趋化因子表达并向局部聚集,介导抗感染免疫,促进病原微生物的清除[3]
        本研究采用RT-PCR分析EV-A71感染的人Jurkat T细胞,分析其TLR1~TLR10 mRNA的表达情况,阐明TLRs在EV-A71致炎症机制中的作用。

材料与方法  

1.材料与试剂:  EV-A71毒株由深圳市CDC于2014年从手足口病患儿粪便中分离获得,经稳定传代、测序鉴定后由本实验室保存。病毒滴度为103细胞培养半数感染量(cell culture infective dose 50%,CCID50)/ml。人Jurkat T细胞购自上海中国科学院细胞库。RPMI-1640、胎牛血清购自美国Gibco公司;RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、Taq酶和一步法SYBR RT-PCR试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司;髓样分化因子(myeloid differentiation factor88, MyD88)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司;白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)细胞因子检测试剂盒购自美国Life Technologies公司;PCR引物由宝生物工程(大连)公司合成。

2.细胞培养与病毒感染:  将人Jurkat T细胞接种于含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,置37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养,每3天换培养液。将上述生长状态良好的人Jurkat T细胞用生长培养基调整浓度(5×105个/ml),按每孔2 ml接种于六孔细胞培养板中培养,24 h后感染组每孔接种200 μl滴度为103 CCID50/ml的病毒液,对照组每孔接种200 μl RPMI-1640培养基,每组做3个复孔,接种后每天在倒置显微镜下观察并记录细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),同时收集感染6、12、24、48 h的实验组和对照组细胞,PBS洗2次,放-80 ℃保存用于提取RNA。

3.Real-time PCR:  培养不同时间后,收集感染组和对照组人Jurkat T细胞提取总RNA,反转录成cDNA,获得的cDNA用作普通PCR模板,引物序列、条件参见文献[4],以目的基因的条带灰度与内参的灰度比值表示基因的表达水平。RNA用作Real-time PCR模板,在ABI7500 Real-time PCR仪上进行扩增,反应条件: 42 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40个循环。实验重复3次,每次反应均设置熔解曲线分析,以证实无非特异性扩增发生。反应完成后根据目的基因和β-肌动蛋白(β-actin)的Ct值,以未感染组为基线,按照2-ΔΔCt方法计算感染组相对于对照组的基因表达水平。

4.免疫印迹法测定MyD88蛋白的表达:  收集5×106~10×106个对照组及感染24、48 h的感染组细胞,冷PBS洗2次,于细胞沉淀中加入蛋白裂解液200 μl,混匀,冰上30 min;4 ℃,12 000×g离心15 min,吸取2 μl上清测定蛋白浓度,剩余蛋白样品中加入5×电泳样品缓冲液,煮沸5 min。取20 μl裂解物经含体积分数8%的SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上。采用ECL试剂显影后,以目的基因的条带灰度与内参蛋白的灰度比值表示蛋白质的表达水平。

5.细胞因子测定:  收集培养24、48 h感染组和对照组细胞上清,ELISA检测细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的分泌水平。

6.统计学分析:  采用SPSS 18.0软件进行统计学分析,TLR7 mRNA、细胞因子分泌水平符合正态分布,采用表示,采用单因素方差分析比较各组TLR7 mRNA、IL-6、TNF-α细胞因子分泌水平,采用LSD-t检验比较不同时间感染组与对照组TLR7 mRNA的表达。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果  

1.EV-A71感染人Jurkat T细胞形态学变化:  EV-A71感染人Jurkat T细胞3~5 d即出现典型CPE,在倒置显微镜下观察,部分细胞体积明显增大、透亮、折光性强、呈气球样变。随着感染时间的延长,肿胀细胞数量变多且内颗粒物增多,细胞透光性降低并逐渐破碎死亡,对照组细胞无CPE现象(图1)。

图1肠道病毒71型感染人Jurkat T细胞后细胞病变效应(×400)

2.EV-A71感染人Jurkat T细胞TLR1~TLR10 mRNA的表达:  培养24 h后,RT-PCR检测TLR1~TLR10 mRNA的表达。除TLR2外,TLR1~TLR10在人Jurkat T细胞上均表达,其中TLR3、TLR6、TLR7、TLR9表达较高,TLR1和TLR10表达较低。与对照组相比感染组TLR7表达水平有增加。分别收集感染6、12、24、48 h的感染组和对照组细胞进行分析,通过计算PCR条带灰度值,发现感染12 h后TLR7 mRNA的表达量开始增加,其他TLRs mRNA未见增加。

3.EV-A71感染对TLR7 mRNA表达的影响:  TLR7 mRNA在细胞感染6、12、24、48 h后的相对表达量分别为1.26±0.15、1.75±0.20、2.26±0.23、3.74±0.62,均高于对照组(t值分别为-2.96、-6.38、-9.57、-7.71,P值分别为0.041、0.003、0.024、0.011);6组间比较,差异有统计学意义(F=35.49,P<0.001)。

4.EV-A71感染对MyD88蛋白表达的影响:  采用Western blot检测EV-A71感染后人Jurkat T细胞中MyD88蛋白表达的变化,结果发现,感染24 h和48 h后,MyD88蛋白表达水平与对照组相比分别增加1.34倍和2.17倍,该结果提示EV-A71感染后TLR7下游信号通路被激活。

5.EV-A71感染人Jurkat T细胞培养上清中IL-6、IL-8和TNF-α的分泌水平:  培养24 h和48 h后,与对照组相比,感染组IL-6的分泌水平明显升高(P值均<0.05)。TNF-α的分泌水平仅在感染48 h后升高,且差异有统计学意义(P=0.003)(表1)。感染组和对照组上清中IL-8的分泌水平均低于检测下限(31.3 pg/ml)。

表1两组人Jurkat T细胞上清液中IL-6和TNF-α分泌水平比较(n=3)

讨论  EV-A71进入机体后可侵犯多种细胞[5,6,7],包括T细胞、树突状细胞、血管内皮细胞、结肠上皮细胞及各种神经细胞。T细胞是一类重要的免疫细胞,在肠道病毒感染后的免疫发病机制中起主导作用。TLRs是细胞表面一类受体,如同天然免疫的眼睛,监视与识别各种不同的疾病相关模式分子,它在炎症、免疫、病原体识别,在宿主的天然免疫中具有重要作用。与病毒感染有关的TLRs主要包括TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9。目前已经证实的TLRs信号主要有两种:MyD88依赖的信号通路和MyD88非依赖的信号通路。有研究表明,TLR7以MyD88依赖的信号通路活化免疫细胞诱导促炎症因子和Ⅰ型干扰素的产生[8]。本研究发现EV-A71感染后TLR7 mRNA的表达增加,MyD88蛋白表达增加。表明EV-A71可能主要通过TLR7被T细胞识别,进而激活下游信号通路,启动机体抗病毒免疫。
        MyD88下游的信号通路有两条,一条通过IKK信号通路调控炎症基因转录;另一条通过MAPK信号通路调控IL-1、IL-6和TNF-α等炎症因子的转录[9,10]。以往的研究显示,机体免疫功能特别是细胞因子水平对感染性疾病进展起重要作用。有研究者认为,感染EV-A71后出现脑炎和肺水肿等严重并发症和IL-6过度产生介导的免疫反应相关[11]。Lin等[12]研究指出,IL-6可以进一步激活IL-1β和TNF-α的生物活性。本研究发现EV-A71病毒感染人Jurkat T细胞后,IL-6和TNF-α的分泌增加。
        本研究以T淋巴细胞为主要靶细胞,探讨了T细胞识别EV-A71感染的模式识别受体。认为EV-A71感染时,T细胞通过TLR7被激活,诱导产生大量促炎因子,参与EV-A71感染炎症反应的病理过程。该结果将为EV-A71致病机制及手足口病的诊治提供新思路。

参考文献
[1]许文波,檀晓娟.肠道病毒71型疫苗使用策略[J].中华预防医学杂志, 2014, 48(6):443-444.DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2014.06.004.
[2]OngKC, BadmanathanM, DeviS, et al. Pathologic characterization of a murine model of human enterovirus 71 encephalomyelitis[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2008, 67 (6):532-542. DOI: 10.1097/NEN.0b013e31817713e7.
[3]周燕,郑瑞娟,胡忠义.Toll样受体基因多态性与结核病易感性的研究进展[J].中华预防医学杂志,2011,45(1):73-76. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2011.01.017.
[4]ChiJ, WangF, LiL, et al. The role of MAPK in CD4+ T cells toll-like receptor 9-mediated signaling following HHV-6 infection[J]. Virology, 2012, 422 (1):92-98. DOI: 10.1016/j.virol.2011.09.026.
[5]罗文英,赵卫,彭亮,等.肠道病毒71型感染人脑微血管内皮细胞的初步研究[J].第二军医大学学报,2014,35(3):240-245. DOI: 10.3724/SP.J.1008.2014.00240.
[6]杜伯雨,白璐,沈岩,等.肠道病毒EV-71感染对T细胞免疫功能影响的研究[J].医学研究杂志,2010,39(8):50-53. DOI: 10.3969/j.issn.1673-548X.2010.08.014.
[7]侯学伶,李祥,彭宏君,等. EV-71感染横纹肌肉瘤细胞与MAPK信号通路分子基因差异表达的相关性[J].临床检验杂志,2012,30(8):605-609.
[8]DieboldSS, KaishoT, HemmiH, et al. Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA[J]. Science, 2004, 303 (5663):1529-1531. DOI: 10.1126/science.1093616.
[9]MedzhitovR. Toll-like receptors and innate immunity[J]. Nat Rev Immunol, 2001, 1 (2):135-145. DOI: 10.1038/35100529.
[10]KonnoH, YamamotoT, YamazakiK, et al. TRAF6 establishes innate immune responses by activation NF-kappa B and IRF7 upon sensing cytosolic viral RNA and DNA[J]. PLoS One, 2009, 4 (5):e5674. DOI: 10.1371/journal.pone.0005674.
[11]WangSM, LeiHY, HuangMC, et al. Modulation of cytokine production by intravenous immunoglobulin in patients with enterovirus 71-associated brainstem encephalitis[J]. J Clin Virol, 2006, 37 (1):47-52. DOI: 10.1016/j.jcv.2006.05.009.
[12]LinTY, HsiaSH, HuangYC, et al. Proinflammatory cytokine reactions in enterovirus 71 infections of the central nervous system[J]. Clin Infect Dis, 2003, 36 (3):269-274. DOI: 10.1086/345905.