中华预防医学杂志    2016年03期 纳米金信号放大石英晶体微天平快速检测己烯雌酚    PDF     文章点击量:2592    
中华预防医学杂志2016年03期
中华医学会主办。
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刘小燕 彭媛 白家磊 郄志伟 宁保安 高志贤
LiuXiaoyan,PengYuan,BaiJialei,QieZhiwei,NingBaoan,GaoZhixian
纳米金信号放大石英晶体微天平快速检测己烯雌酚
Rapid detection of diethylstilbestrol using a quartz crystal microbalance with gold nanoparticals amplification
中华预防医学杂志, 2016,50(3)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.03.016
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投稿日期: 2015-07-24
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纳米金信号放大石英晶体微天平快速检测己烯雌酚
刘小燕 彭媛 白家磊 郄志伟 宁保安 高志贤     
刘小燕 450001 郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室
彭媛 军事医学科学院卫生学环境医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
白家磊 军事医学科学院卫生学环境医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
郄志伟 军事医学科学院卫生学环境医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
宁保安 军事医学科学院卫生学环境医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
高志贤 军事医学科学院卫生学环境医学研究所 天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室
摘要: 目的  构建具有高灵敏度和高选择性的石英晶体微天平(QCM)免疫传感器,实现对己烯雌酚(DES)的快速检测。方法  利用葡聚糖还原法制备粒径为40 nm的修饰有氨基的纳米金颗粒,将其与DES抗体偶联,制备纳米金-抗体偶联物。将晶片浸泡于5 mmol/L的巯基十一烷酸(MUA)溶液中16 h,用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后,取20 μl 2.2 mg/ml的DES完全抗原(DES-HS-BSA),滴加于晶片表面,实现DES-HS-BSA在晶片表面的固定。另取50 μl 1 mol/L的乙醇胺溶液(pH 8.5)进行封闭,制备能够特异性识别DES的敏感膜。将QCM免疫传感器作为检测平台对反应条件进行优化,在优化条件的基础上,将10 μl 28 μg/ml的纳米金-抗体偶联物和10 μl 0.032~2.5 μg/ml的DES溶液混合均匀后滴加于制备有敏感膜的晶片表面,用QCM免疫传感器进行检测并绘制标准曲线。根据标准曲线方程计算最低检出限。对相同浓度的DES及其结构功能类似物进行检测,评估QCM免疫传感器的特异性。结果  DES-HS-BSA的最佳固定浓度为2.2 mg/ml;7 μg/ml的DES抗体和15 nmol/L的纳米金颗粒为两者的最佳偶联浓度;纳米金-抗体偶联物的最佳浓度为14 μg/ml。在0.16~500 ng/ml范围内,DES浓度的对数值与频移呈线性关系,标准曲线方程为Δf=-24.17 lgCDES+69.72,R2=0.998。该方法的检出限为0.13 ng/ml。DES结构功能类似物不会对DES的检测造成明显的干扰,该传感器具有很好的特异性。结论  纳米金信号放大QCM免疫传感器能够快速灵敏的对DES进行检测。
关键词 :金属纳米粒子;生物传感技术;己烯雌酚;石英晶体微天平;自组装
Rapid detection of diethylstilbestrol using a quartz crystal microbalance with gold nanoparticals amplification
LiuXiaoyan,PengYuan,BaiJialei,QieZhiwei,NingBaoan,GaoZhixian     
Department of Nutrition and Food Hygiene, College of Public Health, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China
Corresponding author:Gao Zhixian, Email:gaozhx@163.com
Abstract:Objective  To develop a quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor with high sensitivity and selectivity for the rapid detection of diethylstilbestrol.Methods  Dextran was used as reducing agent for preparing gold nanoparticles (AuNPs) with the size of 40 nm. The AuNPs were coupled with anti-DES antibody after amination. A monolayer was generated after immersing the quartz crystal into the solution of 5 mmol/L 11-mercaptoundecanoic acid(MUA) for 16 hours. After the monolayer was activated by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropry) carbodiimide hydrochloride (EDC·HCl) and N-hydrosuccinimide (NHS), 20 μl of 2.2 mg/ml DES-HS-BSA was dropped onto the surface of crystal to prepare a sensitive membrane which can recognize DES specifically. Then, 50 μl of 1 mol/L ethanolamine (pH 8.5) was used to seal the carboxylic groups to make the sensitive membrane which could identify DES specifically. QCM immunosensor was used as detection platform to optimize the reaction conditions. Under the optimized conditions, 10 μl of 28 μg/ml AuNPs-antibody was mixed with 10 μl of 0.03-2.5 μg/ml DES, and the mixture was added on the sensitive membrane. QCM immunosensor was used to detect the signals and the standard curve was obtained at the same time. The detection limit was calculated based on the standard curve. The specificity was evaluated by testing DES and its analogues with the same concentration.Results  The optimized concentration for the immobilization of DES-HS-BSA on the surface of QCM was 2.2 mg/ml. The optimized concentration for coupling anti-DES antibody with AuNPs was 7 μg/ml and 15 nmol/L, respectively. The optimized concentration of AuNPs-antibody was 14 μg/ml. The logarithm of DES concentration was proportional to the frequency shift in the range of 0.16-500 ng/ml, Δf=-24.170 lgCDES+69.71, R2=0.998. The detection limit of this method was 0.13 ng/ml. DES analogues could not influence the detection of DES obviously, so the sensor had good specificity.Conclusion  The quartz crystal microbalance immunosensor with gold nanoparticals amplification could detect DES sensitively and rapidly.
Key words :Metal nanoparticles;Biosensing techniques;Dierhylstilbestrol;Quartz crystal microbalance;Self-assembled monolayer
全文

20世纪90年代以来,环境化学物的内分泌干扰效应引起了学术界和公众的极大关注[1]。己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)是一种典型的环境内分泌干扰物,具有促进动物生长的作用,由于其价格便宜,经济效益好,广泛应用于牲畜的饲养[2,3]。但是,DES会通过食物链对人类健康造成严重威胁,摄入过量DES会引起致畸、致癌、致突变[4]。我国已经明令禁止将DES用于食品动物,但DES的违法滥用现象依然存在[5]
        目前,生物传感技术以其崭新的内容和独特的优点得以迅速发展,并在生物检测方面得到广泛应用[6,7,8]。纳米金颗粒具有极好的生物相容性,它和生物分子结合后并不会影响生物分子的活性,因此在生物传感器构建中成为极好的信号放大材料。本研究旨在构建一种纳米金信号放大石英晶体微天平(quartz crystal microbalance,QCM)免疫传感器,确定反应的最佳条件,实现对食品中DES快速灵敏的检测。

材料与方法  

一、试剂与仪器  

1.试剂:  DES、巯基十一烷酸(MUA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、葡聚糖(20 000)、牛血清蛋白(BSA)均购自北京百灵威科技有限公司,乙醇胺购自天津市富宇精油化工有限公司,氯金酸(Sigma)、戊二醛溶液购自天津大学科威公司。超滤水通过超纯水系统Millipore-Milli-Q制备。

2.仪器:  QCM测试仪(SR200,天津德尚科技有限公司),超滤管(100 kD,上海瑞丞实业有限公司),涡旋振荡器(MS3 digital,德国IKA集团),台式离心机(TGL-16M,北京雷勃尔医疗器械有限公司)。

二、实验方法  

1.氨基化纳米金的制备:  采用葡聚糖还原法[9]制备粒径大约40 nm的修饰有氨基的纳米金颗粒并进行优化。所有玻璃仪器均用重铬酸钾溶液和王水浸泡并用去离子水冲洗。在250 ml的圆底烧瓶中加入160 ml质量分数为7.5%的葡聚糖溶液,加热煮沸后迅速加入4.32 ml氯金酸(1 g/ml)溶液,持续沸腾至溶液变为紫红色。移去加热源,室温冷却后,用100 kD超滤管离心并清洗4次,溶解于4 ml去离子水中得到葡聚糖包覆的纳米金颗粒。将200 μl 1 mol/L的氢氧化钠溶液加入到4 ml上述溶液中,涡旋15 s后加入60 μl环氧氯丙烷,室温下震荡孵育12 h,用100 kD超滤管离心并清洗4次,溶解于4 ml去离子水中得到环氧化的纳米金。向4 ml环氧化纳米金溶液中加入120 μl的氨水,室温下震荡孵育24 h,用100 kD超滤管离心并清洗4次,溶解于4 ml去离子水中得到氨基化纳米金,于4 ℃保存。

2.纳米金-抗体偶联物制备:  取15 nmol/L的氨基化纳米金水溶液离心后将沉淀物溶解于PBS溶液中,取300 μl该溶液加入到400 μl质量分数为2.5%的戊二醛溶液中,室温下涡旋振荡反应30 min后,12 281×g离心10 min,用PBS溶液清洗沉淀3次后,溶解于300 μl PBS溶液中。将300 μl浓度为7 μg/ml的DES抗体加入到上述溶液中,37 ℃震荡孵育30 min,4 650×g离心10 min,用PBS溶液清洗沉淀3次后,加入500 μl质量分数为1%的BSA,置于37 ℃恒温箱中,18×g震荡孵育40 min,4 650×g离心10 min,弃上清,沉淀用PBS溶液清洗3次,溶解于300 μl的PBS溶液中,于4 ℃保存。

3.QCM免疫传感器的构建:  (1)晶片清洗:将晶片在1 mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡20 min,再用1 mol/L的盐酸溶液超声5 min,最后用浓硫酸与过氧化氢体积比为1∶3超声1 min。清洗后,均使用去离子水和乙醇冲洗干净,并用氮气吹干。(2)敏感膜的制备:将干净的晶片浸泡于5 mmol/L的MUA溶液中,并缓慢摇晃16 h,用乙醇和去离子水冲洗,氮气吹干。向晶片一面滴加200 μl 400 mmol/L的EDC·HCl和100 mmol/L的NHS的混合溶液,于室温(25 ℃)条件下活化20 min后,用乙醇和去离子水冲洗,氮气吹干。取20 μl 2.2 mg/ml的DES完全抗原(DES-HS-BSA),滴加于活化好的晶片表面,37 ℃孵育2 h后,去离子水冲洗,氮气吹干。将50 μl 1 mol/L的乙醇胺溶液(pH 8.5)滴加于固定有DES-HS-BSA的晶片表面,37 ℃孵育30 min,封闭未结合的羧基位点,去离子水冲洗,氮气吹干。于4 ℃储存备用。

4.反应条件的优化:  (1)DES-HS-BSA浓度的优化:选取不同浓度(0.13、0.27、0.55、1.10、2.20、3.30 mg/ml)DES-HS-BSA滴加于自组装后的电极上,用QCM免疫传感器进行检测,每个浓度测3次。根据频率变化量的不同来确定最佳的包被原浓度。(2)纳米金与DES抗体偶联浓度的优化:选取不同浓度(1.88、3.75、7.50、15.00、30.00、45.00 nmol/L)纳米金颗粒分别与7.00 μg/ml的DES抗体进行偶联,将偶联物应用于QCM免疫传感器进行检测,每个浓度测3次。根据频率变化量的不同来确定两者最佳的偶联比。(3)纳米金-抗体偶联物浓度的优化:QCM免疫传感器检测范围的大小和抗体偶联物在电极表面结合的数量呈正比,为了使更多的抗体偶联物结合到固定有DES-HS-BSA的电极表面,将不同浓度(1.75、3.50、7.00、14.00、28.00、56.00 μg/ml)纳米金-抗体偶联物滴加于DES-HS-BSA敏感膜上,用QCM免疫传感器进行检测,每个浓度测3次。根据频率变化量的不同来确定最佳的偶联物浓度。

5.标准曲线的建立:  在优化条件基础上,准确称取一定量的DES,经甲醇溶解后用含有体积分数为10%甲醇的PBS溶液稀释成不同浓度(0.032、0.16、0.8、2.5、4、20、100、500 μg/ml)的溶液。取10 μl 28 μg/ml的纳米金-抗体偶联物和10 μl不同浓度的DES溶液混合均匀后滴加于封闭后的晶片表面,37 ℃孵育1 h。去离子水清洗除去未结合的抗体偶联物,氮气吹干,用QCM免疫传感器进行测量,每个浓度测3次,将DES浓度(CDES)的对数值作为横坐标,频移(Δf)作为纵坐标绘制标准曲线。

6.检出限的确定:  在实验条件最优化的基础上,将20 μl 14 μg/ml的纳米金-抗体偶联物滴加于固定有DES-HS-BSA的晶体表面,37 ℃孵育1 h,用QCM免疫传感器进行检测,记录频率变化量。此过程连续重复12次,得出12个频率变化量。取12组数据的均值减其3倍标准差,带入标准曲线方程计算最低检出限。

7.QCM免疫传感器的特异性检测:  己烷雌酚、双烯雌酚、雌二醇、β-雌二醇与DES具有相似的结构,可能影响免疫分析的测定结果。准确取一定量的DES、雌二醇、β-雌二醇、己烷雌酚、双烯雌酚,分别溶解于甲醇中,并用含有体积分数为10%甲醇的PBS溶液稀释,得到浓度为20 ng/ml的DES及其4种结构功能类似物溶液。取10 μl 28 μg/ml的纳米金-抗体偶联物和10 μl上述溶液混合均匀后滴加于晶片表面,37 ℃孵育1 h,去离子水清洗除去未结合的抗体偶联物,氮气吹干后,用QCM免疫传感器进行测量,样品测量3次。以QCM免疫传感器对体积分数为10%甲醇的PBS溶液的测量结果作为空白组。

结果  

一、反应条件的优化  

1.DES-HS-BSA浓度的优化结果:  当DES-HS-BSA浓度在0.13~2.20 mg/ml之间变化时,对应频移分别为(6±0.60)、(8±0.90)、(12±0.98)、(25±0.57)、(29±0.67)、(31±1.45)Hz。频移呈上升趋势,浓度继续增大,频移变化量不明显,故将2.20 mg/ml作为最佳DES-HS-BSA浓度,用于后续实验。

2.纳米金与DES抗体偶联浓度的优化结果:  当纳米金的浓度在1.88~15.00 nmol/L范围内变化时,所对应的频移分别为(7±0.56)、(13±0.35)、(23±0.59)、(45±3.80)Hz。频移呈上升趋势,继续增大纳米金颗粒的浓度,频移几乎保持不变,故将纳米金浓度为15.00 nmol/L,抗体浓度为7.00 μg/ml作为最佳偶联浓度。

3.纳米金-抗体偶联物浓度的优化:  1.75、3.50、7.00、14.00、28.00、56.00 μg/ml纳米金-抗体偶联物对应频移分别为(9±0.93)、(27±0.82)、(48±6.09)、(101±9.60)、(103±9.59)、(105±10.50)Hz。频移呈上升趋势,从14.00 μg/ml开始,随着纳米金-抗体偶联物浓度的增大,频移几乎保持不变,可以认为,电极表面固定的DES-HS-BSA的结合位点已经全部被抗体偶联物占据。故将抗体偶联物的浓度为14.00 μg/ml作为最佳浓度。

二、标准曲线的建立及方法检出限  在0.16~500 ng/ml浓度范围内,DES浓度的对数值分别为-0.80、-0.10、0.60、1.30、2.00、2.70 ng/ml,其对应的频移分别为(91±0.71)、(71±0.75)、(55±0.26)、(38±0.45)、(22±0.39)、(6±0.21)Hz。浓度的对数值与频移呈线性关系,其标准曲线方程为Δf=-24.17 lgCDES+69.72,R2=0.998。经过计算,该方法的检出限为0.13 ng/ml。

三、QCM免疫传感器的特异性结果  图1显示,相对于空白组,DES结构功能类似物的信号响应远远小于DES信号响应,不会对DES的检测造成明显的干扰,说明该传感器具有很好的特异性,能够很好地识别出DES小分子。

图1己烯雌酚与其结构功能类似物的信号响应

讨论  QCM是一种质量传感器,具有纳克级的质量检测能力[10]。为了提高该传感器的灵敏度与检测性能,本研究对传感器构建过程中的反应条件进行了优化,当DES抗体浓度为7 μg/ml时,纳米金浓度为15 nmol/L为最佳偶联比。DES-HS-BSA的固定浓度为2.2 mg/ml时,可最大量的结合MUA自组装膜上的羧基。偶联抗体的浓度为14 μg/ml时,可使电极上固定的DES-HS-BSA结合位点达到饱和。在最佳条件下,该传感器可检测DES小分子的最低浓度为0.13 ng/ml,可定量检测范围为0.16~500 ng/ml,能够满足实践中一般样品的残留检测。
        液相色谱-质谱联用的方法常用于食品中DES含量的确证[11]。常碧影等[12]建立了一种液相色谱-质谱的方法来检测饲料中DES含量,最低检测限为0.5 ng。Chen等[13]利用超高效液相色谱-串联质谱的方法来检测牛奶中的DES,检测范围为2.0~200 ng/ml。与这些方法相比,本研究建立的QCM免疫传感器具有更宽的检测范围以及更低的检测限,并且不需要繁琐的样品前处理步骤,大大简化了操作过程,更适用于现场操作。但是根据农业部《动物性食品中兽药最高残留限量》的规定[14],DES为禁止使用的药物,在动物性食品中不得检出,因此仍需改进和完善检测方法,使该传感器的灵敏度进一步提高,进而降低检测限。

参考文献
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