中华预防医学杂志    2020年02期 2017年中国即食食品中单核细胞增生李斯特菌的分子流行病学特征    PDF     文章点击量:788    
中华预防医学杂志2020年02期
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李薇薇 郭云昌 占利 马国柱 杨祖顺 刘成伟 申志新 王迪 张晓嫒 宋晓红 余波 贾华云 李秀桂 张秀丽 杨小蓉 杨大进 裴晓燕
LiWeiwei,GuoYunchang,ZhanLi,MaGuozhu,YangZushun,LiuChengwei,ShenZhixin,WangDi,ZhangXiaoai,SongXiaohong,YuBo,JiaHuayun,LiXiugui,ZhangXiuli,YangXiaorong,YangDajin,PeiXiaoyan
2017年中国即食食品中单核细胞增生李斯特菌的分子流行病学特征
Molecular epidemiology of Listeria monocytogenes isolated from ready-to-eat food in 2017 in China
中华预防医学杂志, 2020,54(2)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2020.02.012
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投稿日期: 2019-04-03
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2017年中国即食食品中单核细胞增生李斯特菌的分子流行病学特征
李薇薇 郭云昌 占利 马国柱 杨祖顺 刘成伟 申志新 王迪 张晓嫒 宋晓红 余波 贾华云 李秀桂 张秀丽 杨小蓉 杨大进 裴晓燕     
李薇薇 国家食品安全风险评估中心风险监测部,北京 100022
郭云昌 国家食品安全风险评估中心风险监测部,北京 100022
占利 浙江省疾病预防控制中心微生物检验所,杭州 310051
马国柱 陕西省疾病控制中心病原微生物与生物检验所,西安 710054
杨祖顺 云南省疾病预防控制中心卫生检验中心,昆明 650034
刘成伟 江西省疾病预防控制中心营养与食品安全所,南昌 330029
申志新 河北省疾病预防控制中心微生物检验所,石家庄 050024
王迪 北京市疾病预防控制中心营养与食品卫生所 100013
张晓嫒 北京市疾病预防控制中心营养与食品卫生所 100013
宋晓红 山西省疾病预防控制中心消毒监测科,太原 030012
余波 湖北省疾病预防控制中心卫生检验检测研究所,武汉 430079
贾华云 湖南省疾病预防控制中心微生物检验科,长沙 410005
李秀桂 广西壮族自治区疾病预防控制中心微生物检验所,南宁 530028
张秀丽 河南省疾病预防控制中心卫生检测检验中心,郑州 450046
杨小蓉 四川省疾病预防控制中心微生物检验所,成都 610044
杨大进 国家食品安全风险评估中心风险监测部,北京 100022
裴晓燕 国家食品安全风险评估中心风险监测部,北京 100022
摘要: 目的  分析我国即食食品中单核细胞增生李斯特菌的分子流行病学特征。方法  将2017年食品安全风险监测即食食品中分离的单核细胞增生李斯特菌作为研究菌株,共239株,分离自27个省份。对菌株进行全基因组测序,分析其谱系、克隆群(CC)、序列分型(ST)和血清群;通过VFDB和BIGSdb-Lm数据库获得其毒力基因分布;采用微量肉汤稀释法检测菌株对8种抗生素的敏感性;采用核心基因组多位点序列分型方法(cgMLST)进行分子分型。结果  实验菌株分属在3个谱系,以谱系Ⅱ为主,共155株(64.9%);血清群以Ⅱa为主,共133株(55.6%);分为23个CC型,以及1个未分CC型的ST619,其中CC8、CC101和CC87为优势CC型,共占49.4%(118株);仅4.6%(11株)的菌株携带耐药基因,主要为甲氧苄啶耐药基因(7株,2.9%)。所有菌株均携带单核细胞增生李斯特菌毒力岛(LIPI)1,携带LIPI-3和LIPI-4的菌株分别占13.8%(33株)和14.2%(34株),ST619同时携带LIPI-3和LIPI-4。51.5%(123株)的菌株携带应激生存岛(SSI)1,10株CC121菌株均携带SSI-2。核心基因组多位点序列分型方法能将不同谱系、血清群和CC型的菌株明显分开,共分为24个亚群,与CC型基本保持一致。结论  我国即食食品中菌株以Ⅱa型血清群为主,CC8、CC101和CC87为优势CC型,其中,CC87为流行性高毒菌株。基于全基因组测序的分型方法cgMLST分辨力高,可用于我国食源性疾病的监测和暴发识别。
关键词 :利斯特菌,单核细胞增生;分子流行病学;全基因组测序;核心基因组多位点序列分型;即食食品
Molecular epidemiology of Listeria monocytogenes isolated from ready-to-eat food in 2017 in China
LiWeiwei,GuoYunchang,ZhanLi,MaGuozhu,YangZushun,LiuChengwei,ShenZhixin,WangDi,ZhangXiaoai,SongXiaohong,YuBo,JiaHuayun,LiXiugui,ZhangXiuli,YangXiaorong,YangDajin,PeiXiaoyan     
Department of Risk Surveillance, China National Center for Food Safety Risk Assessment, Beijing 100022, China
Corresponding author: Pei Xiaoyan, Email: pxycfsa@qq.com
Abstract:Objective  To analyze the molecular characteristics of Listeria monocytogenes strains from ready-to eat food in China.Methods  A total of 239 Listeria monocytogenes strains isolated from ready-to-eat food in 2017, all strains underwent whole-genome sequencing (WGS) , and comparisons uncovered population structure derived from lineages, clonal complex, serogroups, antimicrobial susceptibility and virulence, which were inferred in silico from the WGS data. Core genome multilocus sequence typing was used to subtype isolates.Results  All strains were categorized into three different lineages, lineage Ⅱ was the predominant types in food, and IIa was the main serogroups. CC8, CC101 and CC87 were the first three prevalent CCs among 23 detected CCs, accounting for 49.4%. Only 4.6% (11 isolates) of tested strains harbored antibiotic resistance genes, which were mostly trimethoprim genes (7 isolates, 2.9%). All strains were positive for LIPI-1, and only a part of strains harbored LIPI-3 and LIPI-4, accounting for 13.8% (33 isolates) and 14.2% (34 isolates), respectively. ST619 carried both LIPI-3 and LIPI-4. 51.5% (123 isolates) of strains carried SSI-1, and all CC121 strains harbored SSI-2. Different lineages, serogroups and CCs can be separated obviously through cgMLST analysis, and 24 sublineages were highly concordant with CCs.Conclusion  Ⅱa was the main serogroups in ready-to-eat food isolates in China; CC8, CC101 and CC87 were the prevalent CCs, and CC87 isolates was hypervirulent isolates, cgMLST method can be adopted for prospective foodborne disease surveillance and outbreaks detection.
Key words :Listeria monocytogenes;Molecular epidemiology;Genome-wide sequencing;Core genome multilocus sequence typing;Ready-to-eat food
全文

单核细胞增生李斯特菌在自然界中广泛存在,是重要的食源性致病菌之一,人主要通过摄入被污染的食物致病[1],在外界环境耐受力强,可在高盐、低温等环境生长,形成生物膜可长期在食品生产加工企业存活。李斯特菌病虽然发生率低,但住院率和病死率高,易感人群包括孕产妇、新生儿、老人和免疫缺陷的病例[2],主要引起胃肠炎、败血症、神经系统感染及母婴感染,如流产、早产、死胎等[3]。各国陆续报道单核细胞增生李斯特菌引起的食源性疾病暴发,目前我国尚无报告。2010年我国建立国家食品安全风险监测网络,在全国范围内对采集不用食品种类样品开展单核细胞增生李斯特菌污染监测,并于2013年在部分省份开展单增李斯特菌病感染病例的专项监测,以加强我国单增李斯特菌及单增李斯特菌病的监测、溯源及危险因素分析等。本研究对2017年食品安全风险监测即食食品中分离的单核细胞增生李斯特菌开展分子流行病学特征分析,以掌握其种群结构分布特征,为即食食品限量标准的制定、李斯特菌病的溯源等提供基础数据和技术支持。

材料与方法  

1.菌株来源:  将2017年食品安全风险监测即食食品中分离的单核细胞增生李斯特菌作为研究菌株,共239株;分离自27个省份,其中,浙江(41株)、陕西(21株)、云南(20株)、江西(17株)、河北(12株)、北京(11株)、湖北(10株)、山西(10株)、湖南(10株)、广西(9株)、四川(9株)和河南(9株)分离的菌株数量占74.9%。

2.仪器与试剂:  恒温培养箱(美国3M公司),小型高速离心机(德国Eppendorf公司),脑心浸液琼脂(brain heart agar,BHA)和脑心浸液肉汤(brain heart infusion,BHI)购自英国OXOID公司,全基因组DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)。

3.全基因组测序:  选取BHA平板上的单菌落接种BHI过夜培养,按照全基因组DNA提取试剂盒说明书完成DNA的提取,并将样品送至深圳华大基因科技服务有限公司进行全基因组测序(whole genome sequencing,WGS),流程为:对基因组DNA进行质控检测,将检测合格的基因组DNA用物理方法随机打断成300 bp左右的片段,经末端修复、连接A碱基,将特定测序引物连接到DNA片段上,经纯化、扩增后制备文库。文库质量检测合格后,用Illumina Hiseq X Ten PE150进行测序。过滤掉低质量reads后,将raw data导入基于BioNumerics 7.6cn软件建立的国家食源性疾病分子溯源网络(TraNet)进行组装和分析。

4.多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、谱系和血清分析:  实验菌株的序列分型(sequence type,ST)、谱系和血清群[4]均基于全基因组测序结果,利用BIGSdb-Lm数据库(http://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html)分析得到。克隆群(clonal complex,CC)型通过分类数据最小生成树确定,MLST的7个等位基因中仅1个位点不同定为同一CC型。

5.毒力基因分布:  实验菌株的毒力基因分布主要通过VFDB和BIGSdb-Lm数据库获得,筛选的毒力基因包括:单核细胞增生李斯特菌毒力岛(Listeria pathogenicity island,LIPI)1、3和4,应激生存岛(stress survival islet,SSI)1和2,通过BLASTN软件进行比对,设定核苷酸最小一致性为80%。

6.耐药基因和耐药谱分析:  实验菌株耐药基因的筛选通过ABRicate软件中ResFinder数据库完成[5],核苷酸最小一致性设定为75%,最小覆盖设定为90%;生物杀灭剂和重金属抗性基因,包括bcrABCcadACemrEqacATn6188 qac通过BIGSdb-Lm数据库,利用BLASTN软件完成,设定核苷酸最小一致性为80%。采用微量肉汤稀释法检测实验菌株对氨苄西林、青霉素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、美罗培南、四环素、红霉素、万古霉素和环丙沙星8种抗生素的敏感性。

7.核心基因组多位点序列分型(core genome MLST,cgMLST):  cgMLST分析框架采用法国巴斯德的方法,包括单核细胞增生李斯特菌EGD-e参考菌株上1 748个高度保守的核心基因[6],根据cgMLST等位基因不同不超过150个的定义亚群(sublineage,SL)。cgMLST的分析及最大可能系统树通过BioNumerics 7.6cn软件完成。

结果  

1.菌株基本信息:  239株单核细胞增生李斯特菌菌株分别来自流通环节(144株,60.3%)和餐饮环节(95株,39.7%),采样时间为2017年2—11月,以7—9月为主(160株,66.9%),包装类型以散装(包括自行简易包装)为主,只有3株来自预包装食品,其中2株分离自网店食品,1株分离自乳制品。食品类别主要以中式凉拌菜、寿司、生食蔬菜、沙拉和熟肉制品为主,详见表1

表12017年中国即食食品中分离的239株单核细胞增生李斯特菌食品类别分布情况

2.谱系、血清、ST型和CC型分布:  239株实验菌株分属于3个谱系(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ),以谱系Ⅱ为主,共155株(64.9%);分为5个血清群,以Ⅱa为主,共133株(55.6%);分为23个CC型,以及1个未分CC型的ST619,其中CC8、CC101和CC87为优势CC型,共占49.4%(118株);分为33个ST型,9株菌ST型未命名,CC87包括ST87和ST310菌株,CC9包括ST9、ST122和ST1113,CC7包括ST7和ST12,CC1包括ST1、ST308和ST515,CC2包括ST2和ST145,CC5包括ST5和ST1032,CC288包括ST288和ST330,CC14包括ST14和ST91,其余CC型仅包含1种ST型。详见表2图1

图12017年中国即食食品中分离的239株单核细胞增生李斯特菌谱系、血清和CC型生成树
表22017年中国即食食品中分离的239株单核细胞增生李斯特菌谱系、血清和CC型分布情况

3.耐药基因和毒力岛分布:  单核细胞增生李斯特菌对磷霉素天然耐药,均携带fosX基因,未发现氟喹诺酮类耐药基因,只有11株菌株携带耐药基因,占4.6%,包括dfrGtet(M)、tet(K)、tet(S)、VanC4XYaadDant(6)-Iaaph(3′)-ablaZcaterm(B)、lnuAlnuBmef(A)和msr(D)。其中携带甲氧苄啶耐药基因dfrG菌株数最多,共7株,其次是四环素类耐药基因tetM,共6株,其余耐药基因均只有1株菌携带,1株菌最多携带7个耐药基因。所有菌株均完成对氨苄西林、青霉素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、美罗培南、四环素、红霉素、万古霉素和环丙沙星耐药表型的检测,仅发现对四环素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑和红霉素耐药的菌株,携带dfrG的7株菌对甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)最低为0.25/9.5 μg/ml,最高的>8/152 μg/ml;携带四环素耐药基因的8株菌均对四环素耐药,MIC≥32 μg/ml;携带大环内酯类抗生素耐药基因的3株菌对红霉素均耐药,MIC最高>32 μg/ml。所有菌株均不携带cadACemrEqacATn6188 qac基因,只有2株菌携带bcrABC
        239株单核细胞增生李斯特菌均携带LIPI-1,6个基因prfAplcAhlymplactAplcB均阳性。33株菌携带LIPI-3的8个基因IIsAIISGIIsHIIsXIIsBIIsYIISDIISP,占菌株数的13.8%,且均属于谱系Ⅰ菌株。34株菌携带LIPI-4,占14.2%,均为谱系Ⅰ中Ⅱb血清群的菌株,32株为CC87,2株为ST619菌株,且ST619的菌株同时携带LIPI-3和LIPI-4。123株菌携带SSI-1,占51.5%,10株菌携带SSI-2,且均为谱系Ⅱ的CC121菌株。

4.cgMLST分型结果:  谱系Ⅰ中1 748个等位基因差异数最大为1 251个,谱系Ⅱ为1 423个。通过cgMLST分析,共分为24个SL型,基本与CC型一致。按照1 748个基因位点中,≤10个等位基因差异认为同源,9~24个等位基因差异认为可能相关,>25个等位基因差异认为非同源的标准,共识别26组疑似同源菌株,其中32株SL87菌株中有6组疑似同源菌株,见图2

图22017年中国即食食品中分离的32株亚群87单核细胞增生李斯特菌核心基因组多位点序列分型聚类图

讨论  单核细胞增生李斯特菌为胞内寄生菌,可导致侵袭性感染,即食食品中菌株分布及分子流行病学特征对评估其对人群健康的影响极为重要。数据显示肉与肉制品、水产动物及中式凉拌菜等单核细胞增生李斯特菌检出率较高[7],本研究即食食品分离菌株也多来自中式凉拌菜、寿司、生食蔬菜和沙拉等。国际食品法典委员会于2007年正式发布《应用食品卫生通则控制即食食品中单增李斯特菌的准则》[8]。我国GB29921-2013《食品中致病菌限量》设定肉制品中不得检出单核细胞增生李斯特菌[9],修订时根据监测和评估结果拟增加乳制品、水产制品、即食果蔬制品和冷冻饮品中单核细胞增生李斯特菌限量标准,从而有效控制食品中的致病菌污染。
        单核细胞增生李斯特菌主要分为4个谱系、13个血清型,基于PCR分成5个血清群Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅳa和Ⅳb[10]。本研究中菌株主要为谱系Ⅱ,与食品和环境相关,但仍有1/3的菌株为谱系Ⅰ,与临床感染相关,近年由1/2a血清型菌株引起的暴发逐渐增多,本研究中约1/2的菌株为Ⅱa的菌株。由于即食食品或餐饮食品多不经处理直接入口,摄入后对易感人群极有可能引起严重感染。我国即食食品中优势CC型为CC8、CC101和CC87,其中CC87菌株为我国特有的流行性高毒菌株,致病能力较强。
        单核细胞增生李斯特菌耐药情况并不严重,四环素耐药是最常见的耐药表型,本研究中仅检出四环素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑和红霉素耐药菌株,耐药菌株分离自中式凉拌菜、寿司和生食蔬菜中。9株菌携带四环素耐药基因,tetK)基因主要与外排泵有关,tetM)和tetS)主要编码核糖体保护蛋白[11]。7株菌携带转座子Tn 6198上的dfrG基因[12],按照CLSI的判定标准,4株携带此基因的菌株未表现复方新诺明耐药,但MIC值高于其他敏感菌株。
        单核细胞增生李斯特菌的毒力与黏附侵入细胞、胞内存活增殖、细胞间扩散能力密切相关。LIPI-1相对保守,对细菌进入胞内存活定植至关重要,本研究中所有菌株携带LIPI-1,目前各国监管部门认为所有单核细胞增生李斯特菌均可致病,统一管控。2008年LIPI-3被发现,编码李斯特菌溶血素S,与胃肠感染及暴发相关[13,14],本研究中携带LIPI-3的菌株,均为谱系Ⅰ,占谱系Ⅰ菌株的39.8%,血清型为Ⅱb或Ⅳb,菌株主要分离自中式凉拌菜和生食蔬菜,各采样月份均有检出,中式凉拌菜和生食蔬菜均为我国传统家常饮食,食用污染食品后极易增加人群患病风险。LIPI-4是新发现编码糖磷酸转移酶的毒力岛[15]。本研究中携带LIPI-4的菌株主要为我国流行菌株CC87,多分离自中式凉拌菜和即食果蔬类,与侵袭性感染密切相关,因此对孕产妇、新生儿等高危人群存在潜在的健康危害。本研究中近50%的菌株携带SSI-1,可增加菌株对酸、盐、胆汁、胃酸等环境的耐受能力[16],所有ST121菌株携带SSI-2可增加菌株在碱性和氧化应激条件下的生存能力[17],提示这部分菌株可在食品生产加工和流通环境中长期存活,增加污染食品和致病的风险。
        目前基于全基因组序列的分析已成为流行病学调查、分子溯源的重要工具,由于cgMLST分辨力高、重复性好,有相对标准化的命名体系,成为发达国家食源性疾病暴发调查的重要手段[18]。本研究发现cgMLST可以将不同谱系和CC型的菌株明显分开,同时制定了判定标准用于暴发识别和调查。本研究掌握了即食食品中单核细胞增生李斯特菌种群结构分布特征,建立了基于全基因组测序技术的标准化溯源分析框架及命名体系,今后将与脉冲场凝胶电泳方法[19]共同应用于食源性疾病暴发的识别和调查工作,为早发现、早控制食源性疾病提供技术保障。

参考文献
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