中华预防医学杂志    2020年02期 中国破伤风抗体检测技术研究进展    PDF     文章点击量:994    
中华预防医学杂志2020年02期
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王传林 李明 吕新军
WangChuanlin,LiMing,LyuXinjun
中国破伤风抗体检测技术研究进展
Research progress of tetanus antibody detection technology in China
中华预防医学杂志, 2020,54(2)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2020.02.021
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投稿日期: 2019-08-27
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中国破伤风抗体检测技术研究进展
王传林 李明 吕新军     
王传林 北京大学人民医院急诊科 创伤救治中心 100044
李明 北京大学人民医院急诊科 创伤救治中心 100044
吕新军 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,北京 100052
摘要: 我国非新生儿破伤风防控形势严峻,强化含破伤风类毒素疫苗(TTCV)的主动免疫是非新生儿破伤风防控的关键。通过破伤风抗体(TAB)检测可以明确个体的TTCV免疫状态,从而正确实施TTCV主动免疫。国外对TAB检测技术的研究呈现停滞状态,而国内有现实的TAB检测需求,破伤风抗体检测技术仍然处于动态发展过程中。本文收集国内也相对有限的TAB检测技术资料,对国内应用和发展的小鼠毒素中和试验(MTNT)、间接血凝法(IHA)、凝胶双向扩散试验或Rubin法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金(CG)法等TAB检测技术进行总结,以期为国内TAB检测提供较全面的依据。由于缺乏国内TAB检测和国际机构、参考试剂的对比研究,我国的TAB检测技术尚未实现国际化认可。我国特殊的破伤风防控形势使得TAB检测技术研究在国内有一定的现实意义,ELISA、CG法等快速检测试剂具备一定的应用价值。
关键词 :破伤风类毒素;疫苗;抗体;酶联免疫吸附试验;胶体金
Research progress of tetanus antibody detection technology in China
WangChuanlin,LiMing,LyuXinjun     
Trauma Center and Emergency Depratment, Peking University People′s Hospital, Beijing 100044, China
Corresponding author: Lyu Xinjun, Email: 73xj@163.com
Abstract:The situation of prevention of non-neonatal tetanus in China is severe. Strengthening the active immunization with tetanus toxoid vaccine (TTCV) is the key to prevent the non-neonatal tetanus. Through the detection of tetanus antibody (TAB), the immune status of individual can be determined, so as to implement the active immunization of TTCV correctly. The research on TAB detection technology is stagnant in aboard, but still in a development process in China since there is a realistic demand for TAB detection. This review collects relatively limited data of TAB detection technology in China, and summarizes the techniques such as mice toxin neutralization test (MTNT), indirect hemagglutination assay (IHA), double agar gel immune diffusion test (Rubin method), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and colloidal gold (CG), in order to provide a comprehensive basis for domestic TAB detection. The TAB detection technology in China has not yet achieved international recognition due to the lack of comparative study of domestic and international institutions and reference reagents. The special domestic situation of tetanus prevention makes the research of TAB detection technology have a certain practical significance, and rapid detection reagents such as ELISA and CG method have a certain application value in China.
Key words :Tetanus toxoid;Vaccine;Antibody;Enzyme-linked immunosorbent assay;Colloidal gold
全文

破伤风(tetanus)是由破伤风梭状芽孢杆菌(clostridium tetani)经伤口侵入机体,在适宜厌氧环境下繁殖,产生破伤风外毒素(tetanus toxin),侵犯神经系统,以肌肉强直性痉挛、苦笑面容为典型临床表现的感染性疾病[1]。全球儿童计划免疫中含破伤风类毒素疫苗(tetanus toxoid containing vaccine, TTCV)的接种对于有效控制破伤风的流行至关重要[1]。然而,随着TTCV诱导破伤风抗体(tetanus antibody, TAB)的衰减,机体外伤后发生破伤风的几率增加[2]。近年来,国内成人破伤风病例时有报道,提示了成人TTCV强化免疫的必要性[3]。临床上,接诊医生应当了解接受外伤处置患者的TTCV免疫史,必要时应当通过必要的TAB检测手段明确患者的TTCV免疫状态,以便进行正确的外伤后破生风预防[4]
        TAB检测技术包括小鼠毒素中和试验(mice toxin neutralization test, MTNT)、间接血凝法(indirect hemagglutination assay, IHA)、凝胶双向扩散试验或Rubin法、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、胶体金(colloidal gold, CG)法、毒素结合抑制试验(toxin-binding inhibition test, ToBI)、神经节苷脂抑制试验、PC-12细胞毒性中和试验[5],其中MTNT、IHA、Rubin、ELISA和CG法在国内已经应用,ELISA和CG法是临床TAB检测的适宜技术。本文就国内TAB检测技术及进展状况进行综述。

一、MTNT法  MTNT法是基于动物的毒素中和实验,基本原理是将破伤风人免疫球蛋白(human tetanus immunoglobulin, HTIG)标准品和待检样品同时进行系列稀释(各稀释度间隔为5%),然后以固定量的破伤风试验毒素中和HTIG标准品和待检样品中的TAB,腹部皮下接种小鼠检测不同稀释度HTIG标准品和待检样品中和作用后的剩余破伤风试验毒素,待检样品的TAB效价以与HTIG标准品对照小鼠同时死亡的最高稀释度来判定。MTNT法需要专业的动物实验室进行,小鼠接种后需要观察5 d,受动物个体差异、试验毒素性质等多因素影响,检测结果稳定性较差,但是该方法反应TAB的体内活性,对于破伤风被动免疫制剂的活性检测有不可替代的作用[6]。MTNT法是WHO和《中国药典(2015年版)》推荐的TAB检测标准方法,其他TAB检测方法的检测效能均以MTNT法评价[6]。MTNT法的检测水平可以达到0.001 IU/ml,依据TTCV临床试验数据,WHO建议的TAB保护水平为0.01 IU/ml,但是对该保护水平值目前仍然存在争议[7]

二、IHA法  IHA法是正向血凝试验,将破伤风类毒素先吸附于鸡红细胞表面,使之成为致敏红细胞,将HTIG标准品和待检样品在Ⅴ型血凝板同时进行系列倍比稀释(16个稀释度),然后以固定量的致敏红细胞与TAB作用,观察不同稀释度HTIG标准品和待检样品的致敏红细胞凝集现象,以出现++以上致敏红细胞凝集的最高稀释度作为反应终点,比较HTIG标准品和待检样品的反应终点判断待检样品TAB效价,待检样品TAB效价(HAU/ml)=致敏红细胞最低检出量×待检样品凝集反应终点对应稀释倍数[8]。IHA法在制备致敏鸡红细胞环节影响因素多、批间差异较大,实验结果需要隔夜观察,肉眼观察凝集终点增加了判断的主观性,检测结果稳定性较差,并且结果单位为HAU/ml,无法与标准国际单位进行换算,同时,该方法对IgM抗体检测更加敏感[8]。IHA法对实验室条件要求较低,操作方便,在国内仍然有一定的应用[9]

三、Rubin法  Rubin法是典型的凝胶扩散试验,需要制备中间有长的凹槽、两侧有加样孔的琼脂糖凝胶板,中间长的凹槽加入固定量的破伤风试验毒素,两侧加样孔加入HTIG标准品和待检样品,经过破伤风试验毒素、HTIG标准品和待检样品的双向扩散和结合,观察比较HTIG标准品和待检样品对应沉淀线判定待检样品TAB效价。Rubin法需要进行24 h凝胶扩散,肉眼观察比较沉淀线精确度不足,仅能进行定性和半定量检测[10]。然而,Rubin法对实验室条件要求较低,用于比较样品TAB效价和某个界值时结果直观,因此在需要进行TAB效价检测的单位中仍有应用价值[11]

四、ELISA法  ELISA法是应用最普遍的抗体检测技术。理论上,间接ELISA、双抗原夹心法ELISA、竞争性ELISA都可以进行TAB效价测定。目前,国内研发的间接ELISA法、双抗原夹心ELISA法已经用于TAB效价测定[9,11],但竞争性ELISA法检测TAB效价在国内还没有相关研究报道。

1.间接ELISA法:  以纯化的破伤风类毒素作为抗原包被ELISA检测板,将HTIG标准品系列稀释品和待检样品加入检测孔,使得TAB与包被抗原结合,TAB再与HRP或生物素-亲和素标记的抗人二抗结合,加入底物显色,酶标仪读取吸光度值(A值),以HTIG标准品效价、OD值分别作为横、纵坐标绘制标准曲线,依据待检样品A值在标准曲线上计算相应效价值。间接ELISA法对实验室要求低,操作便捷,数小时即可完成,同时,对检测样品要求较低,样品使用量极少,是目前应用最普遍的TAB检测技术[11,12]。间接ELISA法需要经过MTNT法评价灵敏性、特异性、稳定性、重复性等系列指标,以确定方法的检测效能[11,12]。由于MTNT法检测TAB稳定性较差,国内研究者在评价间接ELISA法检测TAB效能时通常平行进行IHA和(或)Rubin法检测[9,11]。丁玉江等[11]采用MTNT、Rubin、间接ELISA法同时检测10份TTCV免疫者血浆的TAB效价,每份血浆以每种检测方法测定10次,结果显示Rubin法判定的检测值区间范围与MTNT法检测结果吻合,间接ELISA与MTNT法检测结果呈正相关关系(r=0.987),间接ELISA法检测结果比MTNT法检测结果平均高8.7%,间接ELISA法平均变异系数(coefficient of variation, CV)为4.69%。李荣贞等[12]采用MTNT、间接ELISA法同时检测10份HTIG的TAB效价,MTNT法测定3次计算平均值,同一批次的间接ELISA法试剂盒测定3次计算平均值,结果显示间接ELISA与MTNT法检测结果相关系数r=0.91,间接ELISA法检测同一份质控品的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)或CV为2%~4%。丰达星等[13]对比标准法与间接ELISA法对300份健康人血清的TAB效价检测结果,相关系数r=0.988,间接ELISA法检测灵敏性94.1%,特异性96.8%,标准法检测平均值和间接ELISA法检测平均值之间差异无统计学意义。然而,Perry等[7]对5种不同的TAB效价间接ELISA法检测试剂盒对人血清T的检测结果进行比较分析,发现采用不同间接ELISA法检测试剂盒的检测结果之间差异具有统计学意义,而且这种差异将会影响临床医生对个体免疫状态的评判。部分研究者认为将0.1 IU/ml作为TTCV免疫后TAB阳转的界值(达到保护水平)更加合适。

2.双抗原夹心ELISA法:  双抗原夹心ELISA法以纯化的破伤风类毒素作为抗原包被ELISA检测板,将HTIG标准品系列稀释品和待检样品加入检测孔,使得TAB与包被抗原结合,TAB再与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的破伤风类毒素结合,加入底物显色,酶标仪读取A值,以HTIG标准品效价、A值分别作为横、纵坐标绘制标准曲线,依据待检样品A值在标准曲线上计算相应效价值[9,14]。张国强等[9]利用该方法对630份成年健康献血员血清进行TAB效价检测,结果显示仅有77份血清(12.2%, 77/630)为TAB阳性(≥ 0.01 IU/ml),而对6 228份经过TTCV 3针免疫的献血员血清进行TAB效价检测,结果显示全部血清TAB阳转(≥ 0.01 IU/ml),其中TAB效价<0.5 IU/ml的血清1 946份(31.2%, 1 946/6 228),TAB效价2~8 IU/ml的血清3 733份(60%, 3 733/6 228),TAB效价>8 IU/ml的血清549份(8.8%, 549/6 228)。这项研究揭示出健康成人TTCV免疫已经严重衰退,是外伤后发生破伤风的重要风险因素;同时,TTCV加强免疫对于成年人效果可靠,对于TTCV免疫状况衰退的个体,TTCV加强免疫是必要的,可以防止TTCV免疫状况衰退而发生外伤后的破伤风感染。双抗原夹心ELISA法在TAB检测中应用还不普遍,有待进一步的深入研究。
        张燕等[14]建立了TAB双抗原夹心ELISA检测法,同英国Binding Site公司生产的TAB间接ELISA检测试剂盒进行了比较,对63份样品的检测结果进行分析,相关系数r=0.971,检测结果平均值之间差异无统计学意义。一般TAB间接ELISA法检测时需要将血清进行数千倍的稀释,微小的稀释误差对检测结果的影响较大;张燕等建立的TAB双抗原夹心ELISA检测法在调配时降低了灵敏度,血清作100倍稀释即可,减少了样品稀释对检测结果的影响。
        双抗原夹心ELISA法与间接ELISA法原理类似,操作类似,检测特异性更高,该方法的研究数据在逐步积累,具有良好的应用前景。

3.竞争性ELISA法:  以抗破伤风单克隆抗体作为竞争性抗体构建TAB检测的竞争性ELISA检测方法是现实可行的[5,15]。不同于间接ELISA、双抗原夹心ELISA法检测的是针对破伤风类毒素的总抗体,竞争性ELISA法检测的是破伤风保护性抗体(中和抗体),与MTNT的检测意义相同,因此在理论上具备更高的特异性[5,15]。国内至今尚无检测TAB的竞争性ELISA法相关研究报道,这与TAB检测的间接ELISA法检测效能良好并且普遍应用有关,研究者和使用者都没有足够的理由(必要的数据)去探索另外一种检测性能未知的新方法。竞争性单克隆抗体来源存在一定限制以及在操作方法上较为复杂可能是限制此类方法生产和普遍应用的重要因素。

五、CG法  基于免疫金标记技术(immunogold labelling techique)的TAB检测CG试剂在国内已经研制成功,包括斑点免疫金渗滤法(dot immunogold filtration)和胶体金免疫层析法(colloidal gold immunochromatography)两种检测试剂。胶体金法检测TAB快速、简便,对实验室无任何特殊要求,适合床旁诊断和现场诊断,但是该方法是定性或半定量检测方法,需要TAB定量检测时不适用[15]
        斑点免疫金渗滤法是以硝酸纤维素膜为载体,将破伤风类毒素点样在膜上,封闭,加待检样品,洗涤后加胶体金标记的葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A, SPA),观察显色结果。马霄等[16]以斑点免疫金渗滤法制备破伤风抗体胶体金检测试剂盒(半定量),检测灵敏性达到0.007 8~0.015 0 IU/ml;对31份TTCV免疫豚鼠血清采用该方法、STNT法、IHA法平行检测,结果显示该方法与STNT法相关系数r=0.96,样品TAB效价平均值差异无统计学意义;对11份人血清采用该方法、STNT法、IHA法平行检测,结果显示该方法与STNT法相关系数r=0.999,样品TAB效价平均值差异无统计学意义。
        胶体金免疫层析法是在硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线,检测线侧贴有玻璃纤维膜结合垫,包被胶体金标记破伤风类毒素,质控线侧贴有吸水垫,包被TAB(IgG)。将待检样品和上样缓冲液加入样品孔,在层析作用下前移,溶解结合垫上的胶体金标记破伤风类毒素并发生反应,再前移至检测线、质控线并结合,观察检测线和质控线的颜色。
        由于破伤风类毒素结构相对简单、抗原性良好,以破伤风类毒素为要素制备的ELISA、胶体金试剂检测性能较好,基本能够满足TAB定性和(或)定量检测的要求。基于大量的人群TAB效价检测数据,成人群随着年龄的增长TTCV免疫水平衰减,部分TAB效价低于保护水平(0.01 IU/ml),外伤后发生破伤风的危险增加[16]。由于国内成人TTCV加强免疫并不普遍,从国内成年人破伤风病例报告情况来看,对成人外伤等情况进行TTCV免疫史咨询和TAB效价检测对于补齐成人TTCV免疫缺口是必要的,有助于采取必要的主被动免疫措施降低破伤风发病风险[17,18]。国产TAB检测试剂的检测性能可以满足检测需求,竞争性ELISA法尚无相关报道,但是随着破伤风单克隆抗体研制的快速进展,未来研制TAB竞争性ELISA法的条件更加成熟。新的抗体检测技术也将带动TAB检测技术进一步发展,并在破伤风防控中发挥应有的作用。

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