中华预防医学杂志    2020年08期 2017—2018年上海某医院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子生物学特征研究    PDF     文章点击量:350    
中华预防医学杂志2020年08期
中华医学会主办。
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陈泰尧 葛忆琳 刘雪薇 朱彦祺 陈钟鸣 田靓 朱颖莹 张曦 张红芝
ChenTaiyao,GeYilin,LiuXuewei,ZhuYanqi,ChenZhongming,TianLiang,ZhuYingying,ZhangXi,ZhangHongzhi
2017—2018年上海某医院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子生物学特征研究
Molecular epidemiological characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus during 2017-2018 at a hospital in Shanghai
中华预防医学杂志, 2020,54(8)
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112150-20190819-00669
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投稿日期: 2019-08-19
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2017—2018年上海某医院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子生物学特征研究
陈泰尧 葛忆琳 刘雪薇 朱彦祺 陈钟鸣 田靓 朱颖莹 张曦 张红芝     
陈泰尧 上海市疾病预防控制中心病原生物检定所 200336
葛忆琳 上海市疾病预防控制中心病原生物检定所 200336
刘雪薇 上海市疾病预防控制中心病原生物检定所 200336
朱彦祺 上海市疾病预防控制中心病原生物检定所 200336
陈钟鸣 上海市疾病预防控制中心病原生物检定所 200336
田靓 上海市疾病预防控制中心急性传染病防控所 200336
朱颖莹 上海市疾病预防控制中心病原生物检定所 200336
张曦 上海市疾病预防控制中心病原生物检定所 200336
张红芝 上海市疾病预防控制中心病原生物检定所 200336
摘要: 目的  分析上海市某医院中不同来源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的分子生物学特征,明确上海某医院MRSA的流行特点。方法  收集上海市某二甲医院2017—2018年期间72株MRSA,综合应用多位点序列分型(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法对MRSA菌株进行分子生物学特征分析。结果  72株MRSA中,46株分离自临床病例,26株分离自医院环境。46株临床分离菌株包括33株社区获得性MRSA(CA-MRSA),以及13株医院获得性MRSA(HA-MRSA),且来自医院的不同的病区。感染MRSA的住院患者所在科室以老年科(34.8%,16株)、内科(26.1%,12株)和外科(26.1%,12株)为主。MLST分型结果显示,不同来源MRSA菌株的ST型差别较大,但ST764是不同来源的MRSA菌株的优势克隆群(40.3%,29株),且PFGE聚类结果显示12株不同来源的ST764型MRSA菌株具有较高的同源性(>90%)。结论  ST764型MRSA可能在社区、医院及环境中存在播散,应持续监测MRSA及其变异情况。
关键词 :耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;多位点序列分型;脉冲场凝胶电泳
Molecular epidemiological characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus during 2017-2018 at a hospital in Shanghai
ChenTaiyao,GeYilin,LiuXuewei,ZhuYanqi,ChenZhongming,TianLiang,ZhuYingying,ZhangXi,ZhangHongzhi     
Department of Pathogenic identification, Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336, China
Corresponding author: Zhang Hongzhi, Email: zhanghongzhi@scdc.sh.cn
Abstract:Objective  To identify the epidemic clones of MRSA isolates at a hospital in shanghai.Methods  A total of 72 MRSA isolates have been isolated from a second grade hospital between 2017 and 2018, including 32 CA-MRSA isolates, 13 HA-MRSA isolates and 26 MRSA isolates from environment. In this study, MLST and PFGE typing methods were used to analyze the molecular epidemiology of the MRSA isolates.Results  A total of 72 MRSA isolates have been obtained including 46 isolates from clinical specimens, 26 isolates from environments. The 46 MRSA isolates from clinical specimens consisted of 33 CA-MRSA (community-acquired MRSA) and 13 HA-MRSA (hospital-acquired MRSA). Furthermore, these patients infected with MRSA isolates were mostly distributed in the department of geriatrics (34.8%, 16/46), internal medicine (26.1%, 12/46) and surgery (26.1%, 12/46). MLST typing results showed that ST764 was predominant in isolates from both clinical specimens and hospital environments. Furthermore, PFGE typing results showed that most ST764 MRSA had high homolog (>90%).Conclusion  ST764 MRSA isolates might spread in community, hospital and environments. Therefore, continuous monitoring of MRSA and its variation may be useful in understanding the involvement of epidemic clone, and in searching new strategies to control MRSA infection.
Key words :Methicillin-resistant Staphylococcus aureus;Multilocus sequencing typing;Pulsed fieldgel electrophoresis
全文

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA)是引起医院临床病例感染的重要病原菌之一1。1961年Jevons在英国发现首例MRSA感染后2,MRSA便以惊人的速度在世界范围内蔓延。现在已有多次研究报道医院内MRSA感染的暴发流行,给医院和个人带来沉重的负担。
        MRSA分子流行病学监测研究表明,MRSA的流行病学一直在不断的变化,特定地区MRSA感染主要有几个少数的优势克隆群或克隆引起3,而且这些优势克隆群或克隆经常会发生变化,出现替代现象4。例如在匈牙利,2000年之后,主要流行克隆群ST239被ST228和ST5克隆群所取代5,德国科隆1984—1998年MRSA菌株ST239-SCCmecIII和ST247-SCCmec I克隆(均属于CC8)被ST228-SCCmecI(CC5)替代6。研究发现我国在2000年前后发生了替代,由ST239-t030取代了ST239-t037而成为MRSA的优势克隆群7。MRSA克隆群的替代机制非常复杂,目前尚未系统性研究。可能与菌株本身的特性、抗生素的使用有关。新替代的优势克隆群往往在耐药性及院内传播能力上更有优势。因此及时发现MRSA新克隆并有效的控制克隆播散,对流行病学研究显得尤为重要。

资料与方法  1.菌株来源:收集上海市某二甲医院2017—2018年临床分离MRSA和环境分离MRSA,临床分离MRSA菌株46株,环境分离MRSA菌株26株。根据社区获得性感染诊断标准:住院前以及住院48 h以内发生的感染。医院获得性感染诊断标准:无明确潜伏期入院48 h后发生的感染,有明确潜伏期自入院时起超过平均潜伏期后发生的感染8。33株为CA-MRSA,13株为HA-MRSA。
        2.脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE):按照本实验室技术方案操作。新鲜培养的细菌制备胶块,先经溶葡萄球菌酶裂解后,再加入裂解液中裂解。洗涤后加入SmaI酶切缓冲液酶切4 h。配制1% PFGE电泳胶150 ml、将酶切后的胶块贴在加样梳子上,插入胶架,灌胶。待凝后拔出梳子,启动电泳仪。电泳参数为:脉冲变换范围4~40 s,电压6 V/cm,角度120 °,线性,电泳时间19 h。电泳结束后,Gelred染色,凝胶成像仪拍照。用Bionumerics软件分析结果。
        3.多位点序列分型(multilocus sequencing typing,MLST):MLST分型参考分型网站提供的7个管家基因(www.pubmlst.org/saureus/)。PCR扩增条件:94 ℃预变性5 min,30个扩增循环(94 ℃变性30 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),72 ℃ 10 min,12 ℃保持。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测片段大小后,进行双向测序,拼接后的序列输入http://www.mlstnet/,获得等位基因号和ST型号。应用eBURST v3.0软件分析。

结果  1.MRSA来源情况:72株MRSA中,46株分离自临床病例,26株分离自医院环境。46株病例分离MRSA包括13株HA-MRSA和33株CA-MRSA,且来自医院的不同的病区,其中5株HA-MRSA和11株CA-MRSA来自老年科,2株HA-MRSA和10株CA-MRSA分离自内科,4株HA-MRSA和8株CA-MRSA分离自外科,1株HA-MRSA和2株CA-MRSA分离自急诊,1株CA-MRSA来自康复科,1株HA-MRSA来自重症监护病房,1株CA-MRSA来自中医科。见表1。样本采集大部分为痰样本(50.0%,23株),其次是咽拭子(26.1%,12株),分泌物(15.2%,7株),脓(4.3%,2株),伤口拭子(2.2%,1株)和肺泡盥洗液(2.2%,1株)。26株医院环境分离MRSA主要来自老年科(96.2%,25株)和呼吸内科(3.8%,1株)。被分离的采集部位多样,详见表2

表12017—2018年上海市某二甲医院46株临床分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标本来源及构成
表22017—2018年上海市某二甲医院26株环境分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标本来源及构成
2.MRSA基因型特征分析:72株MRSA菌株均可被分型,除5株属于新型外,其余菌株分型结果如图1所示。CA-MRSA菌株有8个ST型,HA-MRSA菌株有4个ST型,环境分离MRSA有5个ST型。图1显示ST764是优势克隆群,且只有ST764在三种不同来源MRSA菌株中均检出。不同来源的MRSA的ST型别差异较大,多数型别只出现在一种来源的MRSA中。如ST239,ST5,ST965,ST2631只在CA-MRSA中检测到,ST9和ST22只在HA-MRSA中检测到,ST398,ST3066和ST59在CA-MRSA和环境分离MRSA中检测到。
图12017—2018年上海市某二甲医院分离的67株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MLST分型结果图
3.不同来源MRSA菌株的同源性分析:72株MRSA中,除了5株ST398不能分型外,其余67株MRSA均能被PFGE分型。图2是部分菌株PFGE分型的聚类图。PFGE分型结果显示高度多样性,但是ST764型MRSA菌株的PFGE分型显示高度的聚集性,如图1所示,P1克隆群(相似度大于90%)有12个MRSA菌株,均为ST764型。其中5株CA-MRSA,4株HA-MRSA,3株分离自环境。这些菌株来自不同的科室,包括老年科、骨科、中医科、神经内科、急诊和心内科。
图22017—2018年上海市某二甲医院分离的48株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PFGE分型聚类图
本研究结果显示,2017—2018年该医院感染MRSA的住院患者广泛分布于各科室,其中检出率较高的科室为老年科、内科和外科,这3个科室中感染MRSA的住院患者占比超过80%,老年科的患者以老人为主,年龄偏大,免疫力低下且病情多危重,内科为使用抗菌药物频率较高的科室,外科一般侵袭性操作较多,术后多留置引流管等,这些因素都会提高MRSA的感染率。对环节样本分析结果提示污染MRSA菌株的环节比较广,包括被服、床头柜、护工的衣服、门把手、输液架、马桶等。这些环节是医护人员接触较频繁的部位,医护人员的手传播是MRSA传播的主要方式之一9,因此这些环节污染MRSA间接增加了MRSA在医院的播散机会。医院的消毒记录显示这些环节均按照要求进行严格的消毒,MRSA传播的原因,一方面可能因为部分MRSA菌株对医院常用的消毒剂产生了抗力,另一方面MRSA菌株可能以生物膜的形式存在,生物膜的屏障作用能够有效阻碍消毒剂或者抗菌药物对膜深层细菌的杀灭作用10,因此选择合适的消毒剂以及严格的消毒和无菌操作是预防MRSA感染的重要环节。
        MLST分型结果显示ST764为优势克隆群。但很多研究显示在中国大多数地区,ST239是主要的流行克隆群。2009年Liu等11对我国14个城市的MRSA菌株进行分析鉴定发现,ST239是流行克隆群。2010—2011年秦永新等12对全国9家ICU患者MRSA分析结果显示,ST239为流行克隆群。江苏某家医院神经外科发生由ST239引起的暴发13。2012年上海市两家医院的MRSA菌株中ST5和ST59为流行克隆群14。王仁等15对2013—2014年期间上海市两家不同级别的医院分离的临床MRSA研究结果显示ST764为流行克隆群,其次为ST239。这些研究结果提示ST764可能成为最近几年上海市优势克隆群。
        日本学者发现ST764是由ST5的变异形成的新型克隆株,它在ST5基础上获得了两种新的可移动遗传元件,ACMEII和SaPInn54,可增强细胞溶解肽基因的表达,从而提高其生存及适应能力16,还有研究证实ST764的毒力比ST5强,这也可能是ST764成为优势克隆群的原因。PFGE分型结果显示多数ST764型MRSA的同源性非常高(超过90%),提示ST764型MRSA在医院内存在播散,尽管目前国内没有ST764引起感染暴发的报道,但日本已经报道过一起医院感染暴发,而且ST764有较强的毒力以及环境适应能力16,因此仍需加强对其监测,为控制其播散提供依据。
        本研究分离到ST398和ST9型,这两个克隆群是动物源MRSA的主要克隆群17。近年来报道动物源MRSA通过环境或食物链向人传播18。本研究中的3株ST398型MRSA,均来自骨科,患者受伤感染部位的分泌物所分离。有研究报道皮肤感染实验证实ST398具有较强的手术部位感染潜力。此外在医院环境中分离到2株ST398,提示此医院中可能存在ST398的传播风险。本研究从患者痰液中分离到1株ST9型MRSA,而叶小华19研究结果显示ST9 型MRSA仅见于动物和从业人员中,由此提示这种动物源性ST9菌株有从动物或环境传播给人群定植、感染并在医院传播的可能性。这些结果提示动物源MRSA可能会经过某种途径在社区人群以及住院患者中传播,应该也极其重视,加强监测,为防控MRSA引起的暴发提供数据资料。

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